干细胞样CD4+ T细胞判定及分析
文章概述
文章标题：《Stem-like CD4+ T cells in perivascular tertiary lymphoid structures sustain autoimmune vasculitis》
发表日期和杂志：2023 年发表在Science Translational Medicine上
在线阅读链接：https://doi.org/10.1126/scitranslmed.adh0380
文章简介
文章主要是关于自身免疫性血管炎的研究，特别是关注中等和大型弹性动脉的病变，这些病变可能导致失明、中风、主动脉弓综合征和主动脉瘤。
通过单细胞和全组织转录组研究，识别了一种具有干细胞样特征的CD4+ T细胞群体，这些细胞在血管周围第三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures, TLSs)中存活，并在自身免疫性血管炎的发病机制中起着关键作用。
单细胞实验设计
样本来源：实验使用了三只人源化小鼠分离出的细胞进行scRNA-seq实验,从移植的人体动脉的外膜层分离出CD4+ T细胞。
使用10x Genomics进行测序，对22例主动脉炎患者以及20例非炎症性升主动脉瘤(遗传性主动脉病变和轻度动脉粥样硬化)的42个升主动脉壁样本进行了测序
单细胞转录组数据情况
数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE224528
数据详情：
GSM7025594_Vascular_processed.txt.gz 7.8 Mb
提供的是txt.gz格式的文件，所以使用fread函数读取即可
counts <- data.table::fread('GSM7025594_Vascular_processed.txt.gz',data.table = F)
counts[1:4,1:4]
rownames(counts)=counts$V1
counts=counts[,-1]
sce <- CreateSeuratObject(counts = counts,
project = "Humanized vasculitis mice",
min.cells = 3)
sce
dim(sce)
文章主要分析结果简介
bulk RNA-seq分析
所有的主动脉炎样本都在血管外微血管周围表现出致密的单核细胞聚集
通过bulk RNA-seq分析了主动脉炎(n = 22)或非炎症性主动脉瘤(n = 20)患者的升主动脉组织，分析发现两组共有1070个基因差异表达(P值调整后<0.05)
在主动脉组织中高度富集的DEGs指向正在进行的T细胞和B细胞依赖性免疫反应:
- T细胞(CD3E、CD4、CD8A、GZMB和LTB)
- B细胞(CD19、CD38、SDC1、FCRL3、FCRL5、CR2、LTB、JCHAIN、IGLL5和CD79B)
- 抗原呈递(HLA-DRA、HLA-DMA和CD86)
- 稳态趋化因子(CXCL13, CCL19)
- 增殖和激活(MKI67和BTLA)
这些基因的无偏分层聚类提供了主动脉炎组与疾病对照组和正常主动脉组织的明确分群
通过对差异表达基因(DEGs)的GO富集分析显示，适应性免疫激活途径在主动脉炎中富集
为了捕获与结构化淋巴滤泡形成相关的细胞元件，进行了CIBERSORT分析，两种组织来源都表达了静息CD4+记忆T细胞和单核细胞的基因，而激活的CD4+记忆T细胞和记忆B细胞仅见于主动脉炎。大多数组织浸润性T细胞在主动脉炎中处于静息状态
通过全长转录组分析证实了将三级淋巴组织相关结构置于自身免疫性疾病影响的主动脉壁的组织形态学数据，并为一小部分组织驻留T细胞的原位激活提供了证据。
文章单细胞主要分析流程
使用BioinfoArk提供的中国区chatGPT分析总结了一下文章的单细胞分析流程：
- 数据处理：使用10x Genomics的Cell Ranger处理单细胞fastq数据，并将其映射到GRCh38版本3.0.0的参考基因组上。
- 下游分析：使用R包Seurat（版本4.3.0）进行质量控制、标准化、缩放、降维、聚类、差异表达分析和可视化。
- 质量控制：保留了在超过3个细胞中表达的基因。选取表达200至4000个基因且线粒体基因污染率低于10%的细胞进行分析。
- 去除双细胞：使用DoubletFinder工具去除双细胞（doublets cells），这些是可能影响数据质量的异常细胞。
- T细胞提取：基于CD3和CD4的表达，提取出T细胞，并使用Seurat进行下游再分析。
- 标准化和变量基因识别：对原始计数数据进行标准化，并使用Seurat中的NormalizeData和FindVariableFeatures函数识别变量基因。
- 降维和聚类：使用变量基因进行降维处理，然后采用基于图的聚类方法，使用Louvain算法进行聚类。
- 基因表达插补：使用MAGIC算法对基因表达数据进行插补，以填补缺失的表达值。
- 相关性分析：使用插补后的数据，执行TCF1（T细胞因子1）与其他基因之间的皮尔逊相关性分析。
- 基因模块得分计算：使用Seurat的“AddModuleScore”函数，应用TCR（T细胞受体）信号和细胞周期基因集来计算基因模块得分。
- 伪时间轨迹分析：使用Monocle3进行细胞发展轨迹的伪时间分析，以推断细胞状态转换的顺序。
单细胞分析结果
对分离CD4+ T细胞进行单细胞RNA-seq (scRNA-seq)研究，经过严格的质量控制，保留了680个CD4+ T细胞。为了直接比较来自诱导血管炎的scRNA-seq数据与来自主动脉样本的bulk RNA-seq数据，将scRNA-seq数据合并成一个伪大量数据集。
scRNA-seq转录本聚类产生5个簇，对5个簇的差异基因表达分析显示，它们的转录组谱存在显著差异
基于每个簇中的高表达基因以及转录因子对簇进行判断：
- 簇0的特征是转录因子(TFs) TCF7(编码TCF1)、LEF1和FOXO1的表达，存活相关基因(IL7R)、共刺激分子(CD28、CD27、FAS和CD226)的表达较高，但CD38的表达不高。
- 簇1的基因转录本包括tf BCL6、MAF和TOX2，以及与B细胞辅助功能相关的基因，如IL21、CXCL13和TNFSF8，将它们鉴定为tfh样细胞
- 簇3的基因包括EOMES和SLAMF7，以及参与细胞毒性的基因如PRF1、NKG7、GZMB和GZMK，表达趋化因子CCL4和CCL5
- 簇2和簇4的基因图谱包含细胞周期基因ME2F8、MKI67、PCNA和MCM2
基于这些发现，将这些细胞簇注释为TCF1hi CD4+ T细胞(簇0)、tfh样T细胞(簇1)、cycling(簇2和4)和细胞毒性CD4+ T细胞(簇3)。
基因特征分析显示，cycling2表现出更强的T细胞受体(TCR)信号特征，表明cycling1和cycling2的激活状态不同
CD4+ T细胞亚群之间潜在的谱系关系
使用Monocle3进行了伪时间分析
细胞轨迹从TCF1hi CD4+ T细胞开始，随后分为三个分支，其中两个分支发展为两种不同的效应细胞群——tfh样细胞和细胞毒性CD4+ T细胞，第三个分支产生cycling CD4+ T细胞
scTCR-seq分析
单细胞TCR序列(scTCR-seq)分析检查了TCR克隆型是否在五个不同的T细胞群体之间共享。
从70.7%的CD4+ T细胞中恢复了TRA和TRB的互补区域3 (CDR3)序列，TRA仅来自10.2%，TRB仅来自13.8%。
将克隆定义为两个或更多的T细胞共享相同的α或β TCR链CDR3序列，TRA和TRB均有超过40%的克隆扩增，扩增的克隆型存在于所有5个T细胞簇中
扩增的克隆型在不同的CD4+ T细胞亚群之间是共享的
TCF1hi CD4+ T细胞与所有其他CD4+ T细胞簇共享TCR克隆型
这些结果支持CD4+ TCF1hi T细胞具有高可塑性和自我更新能力，并产生更多分化的效应T细胞的概念
文章小结
- 血管动脉免疫细胞群的单细胞和全组织转录组学研究发现CD4+ T细胞群具有干细胞样特征。
- 提供组织浸润和组织损伤效应T细胞的CD4+ T细胞存活于外血管血管周围的三级淋巴样结构中，表达转录因子T细胞因子1 (TCF1)，具有高增殖潜能，并产生eomesdermin (EOMES)+细胞毒性T细胞和B细胞淋巴瘤6 (BCL6)+ T滤泡辅助样细胞两个效应群。
- 表达白细胞介素7受体(IL-7R)的TCF1hi CD4+ T细胞在一系列移植实验中持续血管炎。
- TCF1hi CD4+ T细胞作为疾病干细胞发挥作用，促进自身免疫性组织炎症的慢性和自主性。