我的第一次ChIP-seq实践

1. 软件安装

整个过程基本是从零开始,也就是说服务器没有安装任何所需软件。因为我平时会用到Python,所以第一步安装的是Anaconda,版本是Anaconda3-4.4.0-Linux-x86_64.sh. Ananconda是一个用于科学计算的Python发行版,能够方便解决多版本Python并存(后面会看到)、切换以及各种第三方包安装问题(最大的好处)。

Anaconda和整个ChIP-seq分析没关系,提到它是因为安装Anaconda后可以用BIOCONDA,能够方便安装管理生物信息软件,无需自己解决软件之间依赖关系。

安装本次实践需要的软件,包括

fastqc(0.11.5), sra-tools(2.8.1), bowtie2(2.3.2), samtools(1.5), MACS2(2.1.1.20160309), deeptools(2.5.1)

    conda config --add channels defaults    conda config --add channels conda-forge    conda config --add channels bioconda    conda install fastqc    conda install sra-tools    conda install bowtie2    conda install samtools    conda install deeptools

MACS2比较特殊,因为它需要Python2.7的环境才能安装,因为我习惯使用Python3,所以安装的Anaconda版本是Python3.6的。为了安装MACS2,首先创建一个虚拟环境,在python2.7的虚拟环境中使用。

    conda create -n py27 python=2    source activate py27    pip install MACS2

用pip没用conda,是因为conda install MACS2需要装好多其他包,我就按照MACS2网站提示pip安装,发现也能用。

2. 数据下载

处理过程中需要下载必要的数据,参考生物信息学常见的数据下载(http://www.biotrainee.com/thread-857-1-1.html)

mm10基因组

    mkdir -p  ~/reference/genome/mm10    cd ~/reference/genome/mm10    wget http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/chromFa.tar.gz    tar zvxf chromFa.tar.gz     cat *.fa > mm10.fa    rm chr*.fa 

build index

    mkdir -p ~/reference/index/bowtie    cd ~/reference/index/bowtie    nohup time bowtie2-build  ~/reference/genome/mm10/mm10.fa  ~/reference/index/bowtie/mm10 1>mm10.bowtie_index.log 2>&1 &

mm10 refseq注释文件,来自http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables。其中track选择RefSeq Genes,output format选择BED,其他参数默认。 头几行得到结果如下。

3. 处理数据

处理的步骤和Jimmy一模一样。 首先需要下载数据,在Jimmy原文中写的清楚,这里也就不赘述了。但是原文截取的原始数据的图好像不太对。我得到的数据如图:

PS:原文截图的确出错了,原文用的是RNA-seq实战的图片,编辑错误。

然后用fastqc看数据质量

    ls *fastq|xargs fastqc -t 10

用Bowtie2将fastqc结果比对到mm10基因组上去

    bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U ../data/SRR620205.fastq| samtools sort -O bam -o cbx7.bam    bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U ../data/SRR620206.fastq| samtools sort -O bam -o suz12.bam    bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U ../data/SRR620207.fastq| samtools sort -O bam -o RYBP.bam    bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U ../data/SRR620208.fastq| samtools sort -O bam -o IgGold.bam    bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U ../data/SRR620209.fastq| samtools sort -O bam -o IgG.bam

得到比对结果如图。大小和原文已经不一样,可能是index,bowtie2版本不同有关。

然后call peaks,首先要进入py27的虚拟环境中

    source activate py27    macs2 callpeak -c IgGold.bam -t suz12.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n suz12 2>suz12.masc2.log    macs2 callpeak -c IgGold.bam -t ring1B.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n ring1B 2>ring1B.masc2.log    macs2 callpeak -c IgG.bam -t cbx7.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n cbx7 2>cbx7.masc2.log    macs2 callpeak -c IgG.bam -t RYBP.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n RYBP 2>RYBP.masc2.log

结果如下。和原文结果很接近。但是原文RYBP2不知道是怎么得到的。

PS:我的RYBP2得到的方式,其实原文有说!

然后是bam转换成bw文件,并画图

    ls *.bam |while read id    do    samtools index $id $id.bai    done    ls *bam |while read id    do    file=$(basename $id )    sample=${file%%.*}    echo $sample    bamCoverage -b $id -o $sample.bw -p 10 --normalizeUsingRPKM    computeMatrix reference-point --referencePoint TSS -b 10000 -a 10000 -R ~/annotation/CHIPseq/mm10/ucsc.refseq.bed -S $sample.bw --skipZeros -o matrix1_${sample}_TSS.gz --outFileSortedRegions regions1_${sample}_genes.bed    plotHeatmap -m matrix1_${sample}_TSS.gz -out ${sample}.png    done

结果如下。其中跑bamCoverage会报错ring1B.bam does not appear to have an index. You MUST index the file first!

先要跑samtools index,生成.bam.bai文件。这个不知道为什么跑原代码没有生成这个文件。

最后画出profile和heatmap图。

    computeMatrix reference-point -p 10 --referencePoint TSS -b 2000 -a 2000 -S *bw -R ~/annotation/CHIPseq/mm10/ucsc.refseq.bed --skipZeros -o tmp4.mat.gz    plotHeatmap -m tmp4.mat.gz -out tmp4.merge.png    plotProfile --dpi 720 -m tmp4.mat.gz -out tmp4.profile.pdf --plotFileFormat pdf --perGroup    plotHeatmap --dpi 720 -m tmp4.mat.gz -out tmp4.merge.pdf --plotFileFormat pdf

得到结果如下

和原文差别好多。后来发现是bamCoverage不需要 --normalizeUsingRPKM这个参数,调整后结果是

现在和原文结果基本一致了。

4.总结

本次实践过程,只是单纯把软件安装,数据下载,代码跑了一遍,其中参数的设置及含义也没有仔细查看,这个要在之后的练习中不断学习。 多谢Jimmy分享的教程,能够让读者快速进入实战分析!

编辑:思考问题的熊&&jimmy

原文发布于微信公众号 - 生信技能树(biotrainee)

原文发表时间:2017-07-14

本文参与腾讯云自媒体分享计划,欢迎正在阅读的你也加入,一起分享。

发表于

我来说两句

0 条评论
登录 后参与评论

相关文章

来自专栏FreeBuf

用Raspberry Pi Zero打造「即插即用」的Web服务器

*本文原创作者:yfgeek,未经许可禁止转载 虽然Raspberry Pi Zero只有4.5英镑,非常便宜,但确实具有局限性,由于缺少网口、WiFi,功能比...

2069
来自专栏FreeBuf

我是如何获取全域用户明文密码的?

简介 在组策略之外,Windows 允许你自定义密码策略,滥用这个机制可以实现一些恶意行为。今天为大家科普下 当我们按下 CTRL + ALT + DEL,修改...

1879
来自专栏吉浦迅科技

放下王者农药这锅,玩一把Tensorflow吧

暑期开始了!对于Lady姐来说,如何安排儿子的暑期生活是一件大事,显然是不能沉迷于王者农药, ? 于是Lady姐随手扔了一个教程给他:按照这份教程,在家里Win...

35710
来自专栏Python小屋

Python使用三种方法批量修改记事本文件编码格式

应用背景:近期计划写一个贝叶斯算法邮件分类的教学案例,苦于没有足够的训练集,就让同学们帮忙每人从自己的邮箱中找几封垃圾邮件把内容复制下来放到记事本文件中发给我,...

582
来自专栏搜云库

在 Linux 上搭建Jekyll静态博客

在CentOS,Ubuntu 按照同样步骤安装,Ruby Gems 往往都无法搭建成,每次都是依赖不对,各种奇葩原因,解决办法就是使用 RVM 安装,解决 Ru...

2388
来自专栏IT笔记

开发银联支付之前要做的那些事儿

1453
来自专栏IT笔记

讯飞语音JavaWeb语音合成解决方案

在线语音合成 将文字信息转化为声音信息,给应用配上“嘴巴”。我们提供了众多极具特色的发音人(音库)供您选择。其合成音在音色、自然度等方面的表现均接近甚至超过了人...

33714
来自专栏格子的个人博客

Jenkins系列一:安装和简单配置Jenkins简单介绍Jenkins安装

Jenkins是一个开源软件项目,旨在提供一个开放易用的软件平台,使软件的持续集成变成可能。

601
来自专栏小白课代表

软件分享 | VC++ 6.0 (WIN10可用)安装教程

Microsoft Visual C++(简称Visual C++、MSVC、VC++或VC)是Microsoft公司推出的以C++语言为基础的开发Window...

963
来自专栏Python小屋

Python+selenium+PhantomJS获取百度搜索结果真实链接地址

祝愿所有参加高考的孩子们都能超水平发挥,考出好成绩,考上理想的学校!也希望你们考上大学之后仍然保持高考前的学习劲头!

583

扫描关注云+社区