使用IGV看序列比对情况

本文从以下五个方面介绍了可视化序列比对数据和相关的tracks：

• 文件格式：推荐的是BAM/SAM，其他格式，并且需要进行sorting&indexing
• Read 覆盖率：整体视图，默认的覆盖率视图，和扩展覆盖率视图
• 序列比对track：颜色、透明度、插入、缺失和排序
• PE序列比对：将reads以pairs形式和颜色来区分，同时可以分为几个屏幕看。

文件格式

IGV推荐使用格式是：BAM以及SAM格式。

除了BAM，GOBY、VCF、PSL、BED、TDF等格式IGV也支持。

Sort和Index

BAM文件在载入IGV前，需要进行sort 和index。Index会生成一个以“.fai”结尾的辅助文件，这个文件会根据文件名自动关联序列比对数据（.bam），导入IGV中。

• 序列比对数据需要以.bam扩展名结尾；
• 在进行index时，文件名必须一致，index文件也必须在同一个文件夹下。 比如：test_xyz.bam文件的index文件名应该是test_xyz.bam.bai,或者是test_xyz.bai。
• 这两步骤可以用samtools或Picard软件进行。

Tracks

载入bam文件后会产生3个相关的tracks:

• Alignment track :显示每个的reads的比对情况
• Coverage track：显示覆盖率和测序深度
• Splice Junction Track：提供一个可选的横跨剪切位点(spanning splice junctions)的reads视图。

一般情况下，前两个tracks会自动出现。这些设置可以通过右键进行修改。

Coverage Track

默认情况下，IGV能动态计算和显示比对文件的覆盖率和测序深度。当IGV窗口放大到reads 可视化阈值大小（默认为30KB）时，这个track会以灰色条形图显示每个位点的测序深度。如果某核苷酸与参考序列不同（超过20%reads）时，IGV会标出不同的颜色。

即：A→绿色；C→蓝色；G→橙色;T→红色。

• 将鼠标悬停在你需要查看的位点处可以看到详细的信息，右键可以复制。

覆盖率数据（TDF）

可用igvtools将BAM文件转化为TDF格式，这个文件是专门显示覆盖率

TDF文件是BAD文件的精简版，当只需要看覆盖率数据时，可用igvtools工具进行转换；方便快速查看。

Alignment Track

当IGV窗口放大到30KB（默认）时，就会显示出各个reads的情况。

• 当窗口放大到一定程度时，IGV的窗口中心会出现一条线，再继续放大，中心线会变为两条，刚好可以框住一个碱基。

结构变异（Structural Variants）

IGV使用颜色和其他的标记来显示变异：SNP、SV、异倍体（aneuploidy）。

IGV使用reads透明度来表示其质量。

• 灰色：和参考基因能比对上的reads；
• 紫色 I：插入；（鼠标悬空在此处能显示插入的碱基信息）
• 黑色横线（—）：缺失；
• 注意：那些透明或者白色的reads有着亮灰色边框的其比对质量（MQ）为0.

Paired-end 比对

对于PE比对，igv可通过右键选择将reads以成对的方式展示。（如下图）

用户可以将需要标记的reads用紫色标记（1），而不同于预期的将会同（3）一样进行标记。

• Ctrl+鼠标单击(Mac:command+click)将paired reads用相同的颜色标记其轮廓，每对颜色都是不一样的。注：黑色外框的reads则该reads没有mate。
• 而Ctrl+鼠标单击(Mac:command+click)任意的一个read都可以去掉这个轮廓。
• 单击右键，选择Go to mate region可以找到PE中的另一条read。
• 如果这对reads的插入片段大小较大，则标记一条read时，其另一条read将不会被标记。
• 停留在一个read上或者单击它，可以看到这条read的信息，包括它paired的另一条read。

在PE比对中，还可以通过右击一个read，选择View mate region in split screen，分屏查看paired mate。（注：若这个read没有mapped mate，则这个选项为灰色）。双击窗口顶端的位点栏，即可恢复正常的单屏视图。

Interpreting Color by Insert size

IGV用颜色来标记异常的插入片段大小的reads，这个只用DNA比对（不适用于RNA-Seq）。

默认的颜色标记规则：如图

• 红色：插入片段大小大于预期值（这里可能有缺失）
• 蓝色：插入片段大小小于预期值（这里可能存在有插入）
• 不同颜色显示PE reads中其mate可在其他染色体上找到（此处可能为染色体间重组）

Interpreting Color by Pair Orientation

• inversions

• duplications

• Translocations

本文简单介绍了使用igv查看序列比对的情况，还有其他模式如Bisulfite Mode，详细可看原文网页（http://software.broadinstitute.org/software/igv/book/export/html/37）。期待大家的交流学习哇。