谁能告诉我,这数据测毁了么?

作者往期投稿: 高通量数据下载还能这样操作?

本次目的与任务:了解fastq测序数据

需要用安装好的sratoolkit把sra文件转换为fastq格式的测序文件,并且用fastqc软件测试测序文件的质量。

作业:理解测序reads,GC含量,质量值,接头,index,fastqc的全部报告,搜索中文教程,并发在论坛上面。

SRA文件转换为fastq文件

用sratoolkit将NCBI上下载的sra文件转换成fastq文件,以便进行下一步的QC。该工具的安装与介绍在转录组入门1中已经有所介绍。这里我再回顾一下sratoolkit的使用:

阅读官方文档

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=toolkit_doc ,我们的目的是把测序sra文件转换为fastq文件,因此点击“fastq-dump”进一步阅读。

查看本地帮助

从进入的这个页面我们能大概了解到fastq-dump命令的基本用法。

然后我在本地的CentOS上又运行了帮助命令 来查看本地版的命令说明。

fastq-dump -h #显示帮助

显然,本地的帮助说明更详细一点。

先看用法:fastq-dump [各种参数] <输入文件的登录号或者路径>

其中,[各种参数]在帮助中有详细介绍,根据博主@徐洲更以及@沈梦圆的文章介绍,我们常用到的参数主要是以下两部分的:

关于输出:

-O 指定输出路径--gzip 指定输出格式为gzip压缩格式(fastqc软件可以直接识别gzip压缩的文件)--bzip2 指定输出格式为bzip2压缩格式**多个文件参数**--split-3 如果是双端测序数据,则输出两个文件,如果不是则只输出一个文件。

明白了fastq-dump的常用参数,我们就得到了转换sra文件的套路

fastq-dump --gzip --split-3 -O path -A accession

具体到我们下载的数据,可以直接用@徐州更博文中的命令进行转换

for i in `seq 56 62`do     fastq-dump --gzip --split-3 -O ./fastq/ -A SRR35899${i}.sradone

以上命令在vim中编辑,保存为.sh文件后,通过bash运行,注意seq前的撇不是单引号。

查看转换结果

转换后生成一系列以.sra1.fastq.gz以及.sra2.fastq.gz结尾的压缩文件。

fastqc检测测序文件质量

多个文件批量进行QC

进入转换后fastq.gz文件所在的文件中,用以下命令生成批量运行的脚本

ls ./*fastq.gz | xargs -i echo fastqc -o ./fastqc_result --nogroup {} \& > fastqc.sh 

运行结果会生成一个名称为fastqc.sh的脚本,运行该脚本即可对当前文件夹下的fastq.gz文件进行QC。

bash fastqc.sh

查看QC结果

单独查看

关于单独的QC结果文件,大家可以看我以前的几个入门帖子了解基本知识。 https://zhuanlan.zhihu.com/p/24608131?group_id=871001548837228544

知乎上@孟浩巍也有写过QC结果的解读,推荐阅读: https://zhuanlan.zhihu.com/p/20731723

MultiQC汇总查看

MultiQC是一款批量查看QC结果的软件,大大节省了我们打开多个QC结果文件的时间,具体使用方式可以查看我的知乎专栏上的介绍: https://zhuanlan.zhihu.com/p/27646873

FastQC报告中哪些是值得关注的

FastQC报告的具体解读可以参考文末参考文献,其中值得重点关注的部分主要是:

  • basic statistics
  • per base sequence quality
  • per base sequcence content
  • adaptor content
  • sequence duplication levels

主要的几个指标是GC含量,Q20和Q30的比例以及是否存在接头(adaptor)、index以及其他物种序列的污染等。

参考文献: 基因课课程《测序数据过滤与质控》( http://genek.tv )
  1. 徐洲更的博文《转录组入门(3):了解fastq测序数据》(微信搜一搜中搜索徐洲更,或者生信媛)
  2. 沈梦圆的博文《PANDA姐的转录组入门(3): 了解fastq测序数据 》(微信公众号:沈梦圆)
  3. 孟浩巍知乎专栏文章《20160410测序分析-使用FastQC做质控》
  4. 用FastQC检查二代测序原始数据的质量( https://www.plob.org/article/5987.html )

编辑:思考问题的熊

原文发布于微信公众号 - 生信技能树(biotrainee)

原文发表时间:2017-07-21

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