【CRISPR】强大的基因编辑工具

一项叫做CRISPR的DNA编辑技术已快速成为最受欢迎的基因组修饰方法之一。然而，对其可能产生风险的担忧似乎给它的一些实际用途降了温——CRISPR可被用于人类胚胎的修饰，也适用各种动植物的基因修饰，从小麦到老鼠，甚至可被用来改变野生动物的种群。对此，《自然》杂志综合了最新的研究进展和从事基因组编辑专家的意见，对CRISPR及其产生的影响进行了报道。

自聚合酶链式反应（PCR）技术以来，CRISPR是生物技术领域内最大的“游戏规则”改变者，这一强大的基因编辑技术在给生物技术领域发展带来巨大潜力的同时，也产生了一些引起人们担忧的紧迫问题。

旧金山格莱斯顿研究所的遗传学家布鲁斯·康克林（Bruce Conklin），一直在试图寻找DNA变化与人类疾病之间的联系，但实验工具复杂且低效：当他对从患者身上采集的细胞进行分析时，难以分清楚哪些DNA序列与疾病相关，哪些是不相干的冗余信息。他认为，通过基因工程令细胞产生突变不仅是一项艰苦的工作，甚至某个基因的改变需要一个学生付出整整一学期的努力。

2012年，当康克林看到一项称为CRISPR的技术可快速改变包括人类在内的几乎任何生物的DNA，他便毅然放弃了之前的疾病建模方式，采用了这种新的基因编辑方法。如今，他的实验室正在进行着与各种心脏疾病有关的基因修饰工作。他说：“CRISPR改变了一切，让我们走出了困境。”

与其他基因编辑技术不同的是，CRISPR成本低廉、使用方便快捷，研究人员希望用它来调整人类基因，消除疾病根源，创造出生命力更强的植物以及更多地造福人类。“CRISPR和PCR是科学事业发展中的两个重要的里程碑。”纽约伊萨卡康奈尔大学的遗传学家约翰·希曼蒂（John Schimenti）说道。PCR的基因扩增方法，自1985年以来彻底改变了基因工程的面貌，而“CRISPR将从多个方面对生命科学产生影响。”

由于这一领域的快速发展，一些科学家开始担心，这几乎没有留给我们多少时间来思考解决这类实验可能产生的道德和安全问题。今年4月，有关CRISPR将对人类胚胎进行基因工程设计的消息一经传开，就成为了众人关注的焦点。虽然胚胎实验并不会导致基因改造的婴儿出生，但依然产生了激烈的争论，争论的焦点是：CRISPR是否应该或如何对人类基因组改造，CRISPR在基因编辑中是否会产生意外失控等潜在风险，以及对生物体基因编辑是否会破坏整个生态系统？

加州斯坦福大学的系统生物学家斯坦利·齐（Stanley Qi）说道：“CRISPR在实验室里很容易利用和发挥。它不需要昂贵的设备，也不需要多年的培训就能使用。但我们需要认真思考的是如何驾驭这种力量。”

基因编辑技术的革命

事实上，十年前分子生物学家就开始利用一些工具对基因组进行编辑。马萨诸塞州布兰代斯大学的分子生物学家詹姆斯·哈伯（James Haber）说道，一种称为锌指核酸酶的酶能够有效地完成这项工作，但其成本高昂，一直未能被广泛采用。而CRISPR的工作原理完全不同，它依赖一种叫做Cas9的酶，可在某种RNA分子的引导下瞄准目标DNA，然后对其进行编辑，或敲除不需要的基因，或插入需要的序列。研究人员通常只需订购RNA片段即可，其他组件可以买现成的，成本只需30美元。“CRISPR令基因编辑操作变得简单化。这是一个巨大的变革。”哈伯说。

CRISPR的出现，意味着一些人要放弃他们多年来已经用得相当顺手的技术。英国威康信托基金会桑格研究所的遗传学家比尔·斯卡内斯（Bill Skarnes）说道：“尽管我很沮丧，但同时我也很兴奋。”之前，斯卡内斯使用的是1980年代中期引入的技术：将DNA插入胚胎干细胞，然后利用这些细胞产生转基因小鼠，不仅耗时成本也昂贵。而CRISPR对基因编辑所花费的时间只是原先工具的几分之一。两年前，斯卡尼斯采用了CRISPR技术。

通常，实验对象大部分是老鼠和果蝇等生物体，如今CRISPR可以对更多生物体进行基因编辑，研究人员可以有更多的选择。今年4月，马萨诸塞州剑桥怀特黑德生物医学研究所的研究人员报道称，他们使用CRISPR对白色念珠菌进行了基因编辑（这种真菌对于免疫力较弱的人可能是致命的），而之前在实验室一直难以对其进行基因操作。基因编辑先驱、伯克利加州大学的詹妮弗·多娜（Jennifer Doudna）迄今已利用CRISPR对多达36个生物体进行了基因操作，其中包括锥虫的致病寄生虫和用于制造生物燃料的酵母。

然而，CRISPR的快速发展也存在一些不足。旧金山加利福尼亚大学的生物物理学家黄波（音译）说道：“首先，没有时间对该系统的一些基本参数进行描述。一种普遍的想法是，用得顺手就行，不用过多的考虑其原理。”黄波和实验室同事花了两个月的时间，才将CRISPR正式用于成像研究。他说，如果知道如何优化向导RNAs的设计，磨合时间可能会更短一些。向导RNAs优化设计可产生细微但很重要的差别。

在研究人员看来，这些不尽如人意之处是掌握新技术所需付出的极小代价，但在多娜看来，她更多担心的是安全问题。在2014年的一次会议上，当她看到一项成果时就开始了这种担忧，即一位博士后将经过基因工程改造的CRISPR病毒组件进入老鼠体内，让CRISPR系统对变异进行基因修饰，以此创建一个人类肺部癌细胞模型。多娜对此感到不寒而栗，因为如果向导RNA设计存在一个小小瑕疵，就可能导致肺部出现大问题。“让学生来处理此类事情是很可怕的，”她说，“重要的是要让人们清楚地认识到这种技术能用来做什么。”

纽约纪念斯隆-凯特林癌症中心的安德烈·文图拉（Andrea Ventura）说，向导RNA设计的目标基因组区域是老鼠独有的，其病毒是不完整的。重要的是要预测风险，哪怕是比较遥远的风险。“向导RNA设计的目的不是破坏人类基因组，但其产生的后果我们可能永远无法知道，”他说，“虽然这种情况不太可能出现，但仍然需要慎重的加以防范。”

对疾病基因进行编辑

去年，剑桥麻省理工学院的生物工程师丹尼尔·安德森（Daniel Anderson），和同事们通过老鼠的CRISPR纠正了一种与遗传性高酪胺酸血症有关的人类代谢疾病的突变基因，迈出了利用基因技术治疗人类疾病的重要一步。这也是首次通过CRISPR修复成年生物体致病突变的一个例子。

在基因治疗领域，尽管CRISPR潜力巨大，但安德森的研究表明今后还有很长的路要走，例如，要将Cas9酶及向导RNA引入肝脏器官中，他们不得不将大量的液体注入血管。通常，实验修正的只是0.4%的致病突变细胞，因此这并不足以对很多疾病产生影响。

安德森等人认为，基因疗法的第一个临床试验可能出现在未来一到两年内，其过程可能会是：将CRISPR组件直接注入眼部等人体组织内，或在实验室把从人体内抽取的细胞进行基因修饰，然后再放回体内——纠正后的造血干细胞可治疗镰状细胞病或β-地中海贫血症等疾病。而将酶和向导RNA引入其他更多组织是一个更大的挑战，尽管研究人员希望这项技术未来可治疗更多的遗传疾病。

有许多科学家告诫说，在安全有效使用CRISPR之前，我们还有许多的工作要做。即在提高基因编辑效率的同时，确保不会对其他至关重要的健康基因产生不利影响。哈伯说：“引入的酶只针对设计标靶，这一点至关重要。如果你想在干细胞内取代某人的镰状细胞基因，首先要保证不会对其他基因造成危害。”

在从事基因编辑的研究中，马萨诸塞州波士顿总医院的基思·乔恩（Keith Joung）开发了一个跟踪Cas9偏离移除标靶的方法。他说，从一种细胞到另一种细胞，从一个基因序列到另一个基因序列，基因移除偏离目标的几率相差很大。他和其他一些实验室的突变频率偏离标靶的几率从0.1%到60%以上。他说，即使是几率较低的意外事件，如果会导致细胞加速生长和癌症，也是很危险的。

面对如此多悬而未决的问题，马萨诸塞州剑桥Editas公司首席执行官卡特琳·博斯利（Katrine Bosley）认为，关键是要把控对CRISPR的预期，同时要让别人相信你的方法可行。“对于我们而言必须要从现实考虑这样一个问题：它会将我们带向哪里？”Editas是一家开发CRISPR的基因疗法公司。

在农业领域内的影响

除了对人类DNA细胞的修饰，CRISPR的另一目标是农作物和牲畜。在基因编辑技术出现之前，研究人员通常将某个基因和细菌、病毒或其他驱动基因表达物种的基因序列，插入到目标基因组的随机位置。其过程不仅低效，也一直成为评论家们的众矢之的，担心这种基因插入可能会破坏原有的基因。更重要的是，转基因作物的培植和获得批准的过程代价及其高昂和繁复。目前转基因作物多为玉米和大豆等商品化产品。

有了CRISPR，情况会有所改观——易用性和低成本特性使得基因组编辑有了更多的“用武之地”。过去几年里，CRISPR创造了基因工程小型猪、去角牛和抗病山羊，以及抗病害的小麦、大米和多维甜橘等。多娜预计，经CRISPR修饰的有机体物种名单会继续增加。她说：“这是植物基因工程实验的又一个发展机遇，无论从研究的角度，或家庭菜园的角度而言，都是一次很有意义的尝试。”

CRISPR具有对DNA序列编辑的能力，使得更为精确的基因修饰成为可能，但也给监管部门带来了难题——很难对某个基因修饰的有机体进行确认。“基因编辑的问世，导致人们失去了对基因工程产品跟踪的能力,”北卡罗莱纳州立大学从事科技政策研究的詹妮弗·库兹玛（Jennifer Kuzma）说道，“以后或将很难判断动植物的基因是自然变异，还是基因编辑修饰的产物。”

这给转基因作物的反对者们敲响了警钟，同时也给如何监管基因编辑的动植物提出了难题。在美国，食品和药物管理局尚未批准任何供人类消费的转基因动物，也未表明将如何对待基因编辑的动物。而现有的一些规定，并不是所有的基因编辑作物都需要美国农业部的监管。今年5月，美国农业部开始寻求如何提高对转基因作物监管的力度，许多人认为这是一种预示，表明针对CRISPR等技术，农业部将重新评估其相关规则。库兹玛说道：“窗口已打开，我们拭目以待，这是一个令人兴奋的事实。”

除了农作物和牲畜之外，研究人员正在考虑CRISPR是否可以应用在一些野生生物上。目前大部分注意力都集中在一种称为基因驱动的新技术，即将外源基因快速引入动物群体，由此消除相关疾病或对虫害和入侵物种进行控制。这项目前还处于早期阶段的技术主要用以消灭携带病毒的蚊子或虱子，以及控制入侵植物或消除困扰一些农民的猪草抗药性。

通常，基因变化在生物群体中需要传播很长时间，缘由是一对染色体上的其中一个变异只能遗传给一半后代。而基因驱动能让CRISPR导致的某个突变由每一对染色体的一半复制到其另一半上，而其后代几乎都将继承这一变异，这意味着它将快于正常的增长速度在整个群体中以指数级速度传播。比如，一旦突变基因进入蚊子体内，仅一个季节就会在整个种群中快速传播开来，如果该突变基因导致蚊子产生更少后代，最终整个蚊子种群连同它们携带的疟疾寄生虫都会自行消亡。

发展前景的喜与忧

然而，许多研究人员担心，改变某个物种或完全消除它们，对于整个生态系统来说可能会产生强烈的未知后果，或出现其他害虫，或影响到高端食物链。研究人员还担心，随着时间的推移，向导RNA也可能会变异，将目标转向基因组的其他不同部位。这种突变可以通过物种群体快速蔓延，从而产生不可预知的影响。

“突变具有不可逆性，会对其他物种可能产生意想不到的或难以预料的影响和风险。”波士顿哈佛医学院的合成生物学家乔治·丘奇（George Church）说道。去年4月，丘奇等专家在《科学》上就这种风险进行预警，并提出基因驱动实验意外泄漏的防范方法。

在当时，基因驱动似乎还是一个遥远前景。但不到一年，圣地亚哥加州大学的发育生物学家伊桑·比伊尔（Ethan Bier）和他的学生瓦伦蒂诺·甘茨（Valentino Gantz ）报告称，他们用果蝇设计了一个系统，即在携带疟疾病毒蚊子的实验室内把果蝇放进采取了安全措施的三层盒子内，但他们没有完全遵照诸如设计一种逆向基因改变指南行事。比伊尔说，他们正在进行第一个理论验证实验，在系统复杂化之前，他们想要确认其是否真正可行。

对于丘奇等人来说，这是一个明确的警告，CRISPR引发的基因编辑普及可能会产生一些意想不到的不良后果。美国国家研究委员会为此专门成立了一个基因驱动问题讨论小组，其他高层讨论也开始跟进。“至关重要的是，国家监管机构和国际组织要真正做好相关的预案。”麻省理工学院“科学评论”主要作者肯尼思·奥耶（Kenneth Oye）说道。奥耶担心，基因驱动科学正在高速发展，相关的监管步子很可能跟不上。

德州农工大学学院站分校的昆虫生态学家米奇·尤班克斯（Micky Eubanks）说道，基因驱动的想法一开始令他震惊。“我最初的反应是，‘哦，我的上帝！这太可怕了！’但如果对已经和继续导致的环境变化进行更多的思考和权衡，这只不过是大海中的一滴水罢了。”

当CRISPR或其他一些新技术出现时，研究人员的心情不外乎夹杂着兴奋和担心，当遭遇挫折时便会感到失望。1990年代，费城宾夕法尼亚大学的医学遗传学家詹姆斯·威尔逊（James Wilson）见证了当时蓬勃发展的基因治疗研究热情，也见证了因临床意外导致一个年轻人死亡。之后，这一领域的研究陷入低潮，直到最近才开始有所恢复。威尔逊说，CRISPR是个很年轻的领域，可能还需要一段时间的发展才能实现其潜力，“目前还在探索阶段，一些想法都需要‘发酵’。”

在威尔逊的实验室引入这一技术之前，尽管他对有关CRISPR前景的一切承诺都持怀疑态度。但威尔逊相信：“它在人类医学治疗中最终会发挥作用，它的前景真的很引人入胜。”