单细胞技术—基因测序新方向
摘自：生物探索 （2014/08/27）
导读：单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。它在个别细胞之间的遗传差异表达方面拥有无与伦比的优势，为癌症发生、发展机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路并开辟了新的研究方向。
什么是单细胞测序
单细胞全基因组测序技术（MALBAC）是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。最早由哈佛大学谢晓亮教授发明，相关论文2012年发表于《科学》 （Science）杂志。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后通过外显子捕获进而高通量测序用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。它解决了用组织样本测序时或样本少无法解决的细胞异质性难题。为从单核苷酸水平深入研究癌症发生、发展机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路并开辟了新的研究方向。
单细胞应用领域
这一新方法还可被广泛用于其他重要的生物研究领域，如组织器官内细胞基因组的异质性研究、干细胞的异质性研究、生殖细胞的遗传重组研究、胚胎的植入前遗传学诊断研究、法医学少量DNA测序等。如下为具体应用领域。
1. 胚胎发育
由于单细胞的获取比较困难，所以目前大多以精子和卵子作为单细胞测序的主要目标细胞。而大规模地进行精细胞和卵细胞的测序，无疑对早期胚胎发育研究有着无可替代的重要意义。这种方法能准确识别单个核苷酸的变化。首次实现了高覆盖度的单个精子全基因组测序，构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱，这一技术方法在男性不育症研究和肿瘤早期诊断及个体化治疗等生物医学领域有着广泛的应用前景。
2.癌症基因
目前来说，单细胞测序最常见的应用是在癌症研究上。由于癌细胞中基因组部分被删除，或者扩增，从而引起关键基因的缺失，或者表达过量，干扰正常细胞生长，因此利用这种方法就能分析基因拷贝数目，从而诊断癌症。以下列出了单细胞测序常应用的领域。
有研究显示，基因或基因组变异是肿瘤发生的根本原因，利用单细胞全基因组测序技术，可以对获取的肿瘤细胞进行更为精确和深入的分析，发现正常细胞与肿瘤细胞差异，了解癌细胞的基因如何突变，以及肿瘤的来源、肿瘤的生长规律、属于哪种基因型等，为早期检测和诊断肿瘤和肿瘤的个体化治疗提供指导。另外，肿瘤的异质性是导致肿瘤耐药性问题的原因。如果 能从单个肿瘤细胞水平对肿瘤单细胞进行测序，并 找出一个肿瘤在单个细胞上的共同结构，揭露出每个肿瘤细胞的突变规律，这将为药物研究、肿瘤的靶向治疗提供基础。
3.微生物单细胞测序
来自J. Craig Venter研究所、加利福尼亚大学以及Illumina Cambridge公司的研究人员就尝试着对加利福尼亚海洋样本中的单个细菌——SAR324细胞基因组进行了测序。该方法可应用于不同环境中的单个细菌细胞进行测序，从大海深处到医院病房及人体内。作者认为，这种经济高效的方法应该有助于微生物分类和进化的探索，且能够挖掘出一些环境微生物，其基因和通路能够为生物技术和生物医学所用。
单细胞测序的特点
精子是天然重组产生的单倍体，取材方便，而且一个人身上可取的精子数量几乎是无限的，可以很容易地研究个人水平的重组分布规律；其次，单细胞全基因组测序技术提供了最高的分子标记密度，减少了偏差，能够得到最为精确的片段交叉重组定位结果，可以非常清晰地揭示片段交叉重组的分布以及个人水平上重组率的分布规律；第三，测序技术本身具有高通量、自动化等特点，随着未来测序成本的进一步降低，可以对一个人更多的精子进行测序，从而获得精度更高的个体特异性的重组率分布图谱，也可以通过比较很多人的精子来研究重组率分布在不同个体之间的差异。
优点
- 使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个
- 别细胞之间的遗传差异。2.降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。
- 这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。
- 灵敏度高：单细胞、单染色体或0.5pg的基因组DNA即可进行扩增。
- 扩增均匀性显著优于其它技术，测序数据可进行CNV分析，用于21三体等染色体变异检测。
- 扩增产物用途广泛：可用于二代测序、微阵列、qPCR、基因克隆。
- 目前，MALBAC技术现在已经成功应用于人类单精子、植入前产前筛查的囊胚和极体、早期发育胚胎、肿瘤细胞、刑侦现场痕量物证和部分微生物。
缺陷
鉴于目前的技术手段，单细胞转录组测序仍然存在覆盖率低的弊端，导致除mRNA以 外的长非编码RNAs难以检测，并且不能区分正义链与反义链。
未来应用
单细胞测序的前景依然是乐观的。美国马里兰州贝塞斯达美国国家人类基因组研究院（National Human Genome Research Institute in Bethesda, Maryland）的遗传学家Elaine Ostrander说：单细胞基因组测序技术是一种让人难以置信的新技术，这种技术的应用潜力无法估量，我们可以凭借这种技术轻而易举的攻克肿瘤难题。
中国华大基因研究院副院长李英睿说：“单细胞测序新方法为遗传异质性肿瘤的高精度、全面评估提供了一个非常优秀的研究工具。这种新方法和产生的数据为鉴定与肿瘤发展相关的候选基因提供了科学依据，也必将会推动癌症的遗传机理和生物学过程更深入的研究。”
相关公司及产品
目前国内有亿康基因有限公司、诺禾致源和华大基因做这方面的服务，相关的技术已经成熟，利用该技术所显现的优势目前并没有显现出来，因为单细胞测序的发展太过于前沿，在大规模基因测序发展到一定阶段后，单细胞测序的价值或许可以体现出来。
亿康基因
亿康基因基于哈佛大学谢晓亮院士研究组研发的一项专利技术——多次退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC）推出了单细胞全基因组/转录组扩增试技术服务，解决了基因组/转录组扩增对微量初始模板过大的扩增偏倚，使基因组测序的模板需求量从µg级降至单细胞水平。
诺禾致源
诺禾采用多次退火环状循环扩增技术（MALBAC），MALBAC 扩增具有低偏倚性。最新《Science》文章比较MALBAC 与MDA 扩增技术，发现MALBAC 扩增后的数据与混合建库的数据质量更为接近，该公司的相关负责人本身就参与了多项单细胞测序的工作。该公司目前已经将单细胞测序产品化，并成为其未来的主要支撑业务。
华大基因
华大基因目前在单细胞测序领域，也有一席之地。