Western Blot一抗的选择

Western Blot中,一抗是一种非常关键的试剂, 因为仅仅是抗体制备和质检都是一项非常复杂的工作,所以对于Western blot实验人员来说如何选择一抗是一件很有挑战的工作,尤其是不完全了解抗体制备过程的朋友更是头疼。

多抗还是单抗

一般来说,多抗识别的表位多,即使Target抗原有些表位被破坏,它仍然可以被多抗识别,但是对于单抗来说就需要很小心了,因为它所识别的那一个表位被遮盖或被修饰时很可能不能与它对应的单抗反应,所以从这个角度来看,多抗是一个比较保险的选择。但是单抗也有独到的地方,例如它更容易实验特异性,尤其是家族成员结构类似的时候,特异的单抗可以将它们分开。单抗的另一个优点就是容易实现批次的稳定性,这个对于将来需要长期研究一个特定的target的朋友非常重要,比如某个抗体可以识别一个特定的isoform,对于多抗来说,很可能在下一个批次里重复不出来这个结果,而单抗则可以很容易实现。所以要仔细权衡才能作决定。(如果是做流式或IHC选择抗体则是另一回事,这里仅讨论WB)。

上哪里查询抗体供应商

搜索抗体主要有三个办法,一是直接参考文献作者使用的抗体来源,二是查询抗体搜索网站,三是直接去知名厂商网站上查询。这三种办法也都是各有讲究的,接下来我会花很大的篇幅一一介绍。

1. 参考文献是最安全可靠的办法,但是一定要注意作者的实验条件和结论。首先保证作者的实验和你的实验必须是同一类实验,也就是说你需要寻找能做WB的抗体的时候看别人做IHC的抗体是没有意义的;其次要看作者的Western blot检测的是内源蛋白还是过表达蛋白或者纯化的蛋白,一般来说,只有内源蛋白的Western blot才有参考意义,但是如果作者做了过表达的WB实验同时还做了干扰后的WB,则可以作为参考;最后要注意的是看作者的结论,并不是所有的作者对他使用的抗体都会有一个正面的评价,有的很可能是批评某家公司的抗体,也有的是把数家公司的抗体一一对照,所以一定要看仔细。有一些文献中作者使用的抗体可能是他人赠送或者自己制备的,不妨发个邮件去或许能免费要一些回来使用。

2. 查询抗体搜索网站,这个必须对常见的抗体资源网站有所了解,这里向大家推荐几个:         首先推荐 Biocompare: http://www.biocompare.com/ 打开网页后在Search Product下的文本框内输入你需要的抗体的抗原名称,in后面的下拉菜单中选择"Antibodies",再search就行了。如果出来很多结果,可以用application进行限定过滤,如果出来的结果不是很多,那就可以一一查看,推荐直接访问每一条的Supplier Page,即可访问供货商的产品页面获得更多信息。        其次推荐Antibodyresource:http://www.antibodyresource.com 打开网页后直接在顶端的search box里输入你需要的抗体的抗原名称,回车后即可返回搜索结果,也可以用application以及其它选项对结果进行过滤。如果配有实验结果数据的,会出现相关的图标(但此处图标不是缩略图)。         接下来推荐Labome: http://www.labome.com 打开网页后直接在顶端的search box里输入你需要的抗体的抗原名称,回车后返回系统生成的一系列关键词,选有antibody的那一个关键词即可返回抗体搜索结果.         然后推荐Antibodypeida: http://www.antibodypedia.com 打开网页后直接在顶端的search box里输入你需要的抗体的抗原名称,回车后下方即返回搜索结果,界面清晰明了,但是收录的抗体公司相对较少。         最后,别忘了“外事不决问谷歌”!大家都知道google容易被和谐,这里推荐大家用这个网址访问google,基本不会出问题:http://www.google.com/ncr 大家记住这个地址一定会派上用场的,呵呵。比如你要搜索xx的抗体,只需要在google里输入“xx antibody”即可。用google搜索出来的结果很多,一般不好筛选,只能一一查看了,另外还有一些重复项和无关项,需要自己判断了。         无论是用哪一个网站搜索都要注意抗原名称,一是不要把其它无关的抗体的抗体当成了自己需要的抗体,因为这些网站都有模糊搜索功能,尤其是当搜索不到你输入的内容的时候,它们可能会返回名称类似的抗原的抗体;二是很多抗原不止一个名字,搜索出来的名字可能不一定是你输入的名字,但是确实是你需要的东西,比如搜索CD31的抗体的时候,很可能出来PECAM1的抗体,而事实上它们是同一个东西,因为CD31也叫PECAM1。同样的原因,如果返回搜索结果为空时不妨换个名称试试。

3. 直接去知名抗体供应商网站上查询 这个对于初接触抗体的人来说是一件相当复杂的事情,因为抗体行业鱼龙混杂,一时难以找到一个可靠而且口碑好的标杆。这里简单对一些世界著名的抗体作个简明的介绍,希望有所帮助。(以下部份由站长结合自身认识以及相关文献报道以及权威网站介绍总结,如有不妥请联系站长。以下部份尽量公正,不接受任何形式的广告要求。)         首先需要说明的是,市场上的抗体公司简单地可以分为两类,一类是生产型的公司(如CST,Proteintech Group, Epitomics,eBioscience,Abgent等),另一种是销售型的公司(如Abcam, Sigma,thermofisher等),其本质区别在于生产型的公司是产品的直接生产者,也就是Manufactor,他们拥有完整的产品生产记录。相反,销售型的公司(Dealer)则是自己不生产产品或者只生产一小部份产品,大部份产品来自于其他一家或多家公司,需要注意的是,这个和代理商(Distributor)又有一些区别,代理商可以看成是一个品牌的产品在一个特定地域的指定销售点,其意义在于建立快捷购货渠道,方便用户订购程序,用户在选择产品时基本上跟代理商没有关系。一般来说在选择抗体上,对于生产型的公司和销售型的公司可能会有以下差别:

生产型公司

销售型公司

产品种类

相对少

价格

技术支持

非常好

较好

产品数据

原始,齐全

视情况而定

产品唯一性

唯一

商家之间很多交叉重复

售前售后服务

好,快捷

较好

到货周期

快,国内非常快

长期购买

稳定

有不稳定因素

从这个对比可以看出,一般情况下站长优先推荐去生产厂家购买抗体,只有当需要的产品很难找到生产商或者需要多个产品它们分布在多个生产商那时的时候才推荐找销售商。好了,言规正传,开始列一些著名抗体公司:

首先说说中外合资的跨国公司吧,一是支持一下本土企业,二是国内订货到货周期短,另外售前售后服务也很方便到位(这一点非常重要,国外抗体咨询投诉周期一般都非常长,国内的公司一般一两天就可以解决),而且中外合资的公司价格也相对便宜许多,近些年来这些品牌也被国内外学术界认可,所以你懂的。其中比较有名的抗体公司推荐这些(这几家都是生产商并且拥有国际品牌): 武汉三鹰生物技术有限公司(Proteintech Group) 总部在美国,公司有12000余种多抗和400多种单抗,90%以上的抗体是用重组蛋白作为抗原生产,产品数据齐全,甚至还公开了抗原序列,其品牌被国内外学术界广泛认可。 杭州宜百康生物科技股份有限公司(Epitomics) 公司产品以兔单抗为主,是全球最早生产兔单抗的公司,产品质量过硬,数据齐全,品牌口碑很好,现已被Abcam收购。 苏州百奇生物科技有限公司(Abgent) 公司有10000多种多抗,几乎所有抗体都用多肽为抗原制备,品牌也还不错。 台湾亚诺法生技股份有限公司(Abnova) 公司抗体种类很多,涵盖物种也广,单抗种类多。

    先就推荐这么多吧,其他的一些公司也有质量不错的,但是考虑到国际品牌认可,就只列这么多吧,需要发文章的朋友使用国内抗体的时候尤其要注意品牌的国际认可程度。一个比较可靠的办法是在专业文献检索的网站上查一下这些公司的品牌,看看是否有很多人引用此公司的产品就知道是否被广泛认可了。推荐大家在Highwire上搜索,既可以提高搜索精度,另外还可以搜索到高质量文献。好了,接下来推荐纯粹的国外的公司吧。 Cell Signaling Technology (CST) 正如其名,CST的抗体在信号通路相关的领域具有很大的优势,其抗体几乎包涵了所有的信号通路,而且产品数据完整,产品背景清晰,质量过硬,被文献引用频率高,深受用户好评。 BioLegend 抗体大部份是面向免疫系统相关的分子以及细胞因子等,而且几乎所有抗体都可以用于流式分析,同时大部份抗体除了祼抗体外还都有不同种类的标记型抗体。 eBioscience 抗体主要面向于免疫系统和癌症相关的分子,和BioLegend类似,大部份抗体都可以用于流式分析,而且也有多种不同类型的标记的抗体。 Dako 抗体产品种类较少,本不应该算在科研试剂供应商的,但是Dako每一个都是精华,尤其是在病理诊断市场上,更是行业的金标准,对需要做免疫组化的同仁更是推荐。 Bethyl Laboratories 是一个相当古老的公司,成立于1972年,抗体种类也不是很多,其特色在于大部份抗体都有IP实验结果,质量也相当不错。 R&D Systems 成立也比较早,其产品尤其在细胞因子相关分子上占有极大的优势,同时拥有配套的高质量ELISA kit,为需要进行定量研究的用户提供了极为有力的工具。 BD Biosciences 公司抗体在CD分子上做得极为全面,而且几乎所有的抗体都不同种类的标记,大部份抗体都可以用于流式分析,质量也相当好。 Santa Cruz Biotechnology 抗体种类则非常多,而且针对同一个蛋白有多个抗体与其对应(主要是免疫原区段不一样),几乎所有抗体都用多肽做抗原。 Santa Cruz的品牌相当悠久,业界也比较认可。     以上都是国外知名的抗体生产商,下面简单列一些销售型的公司,就不一一介绍了:AbcamSigma AldrichThermo FisherACRIS…… 另外还有一些公司既自己生产,也会以自己品牌卖一些其他公司的产品的,也有做得不错的,如Merck MilliporeNovus Biologicals 等。

如何看懂抗体说明书

抗体说明书或者产品介绍因为带有一定的专业性,而且包括的项目繁多,因此完全理解一份说明书或者产品介绍还是相当有难度的,这里对一些常见的术语作一些简单的介绍,希望对大家有所帮助。

抗体的命名 这是个很基础的问题,在搜索抗体以及写文章的时候一般都应该清楚。习惯上,一抗的完整命名应该是:Host Species + anti-React Species + Target Name + Clonality + "antibody", 其中Host species是指用来制备抗体而使用到的实验动物, react species是反应物种,也就是待研究的物种,Target name即研究的抗原对象,Clonality即单克隆还是多克隆,举个完整的例子:Rabbit anti-human KRAS polyclonal antibody, 即由兔子产生的能识别人源KRAS的多克隆抗体,如果一抗被特殊标记的,则在名称前带上标记物,如Horse-radish peroxidase conjugated mouse anti-GST tag monoclonal antibody。关于二抗的命名习惯参考本站“Western Blot二抗的选择、孵育与洗涤”部份。

Tested applications 已测试过的应用,即抗体生产商对抗体进行过的鉴定手段,并且在这些实验中都得到了阳性的结果。通常有WB(Western blot,免疫印迹),IHC(Immunohistochemistry,免疫组织化学),IF(ImmunoFluorescence,免疫荧光),IP(ImmunoPrecipitatioin,免疫沉淀), FCM(FlowCytoMetry,流式细胞分析)。 买抗体时应根据需要选择能满足自己的应用的抗体,比如目的是做WB的,就优先选择说明书上有WB实验数据的,而不能通过能满足其它的应用来推测是否能进行WB,这是很不靠谱的,尽管很多实验之间都有一定的类似性,但是都会有一些细微的差别导致只能进行其中的一种应用,比如很多人认为能进行IF的抗体就一定可以进行IHC,这是非常不对的,尽管在逻辑上这两种实验有一定的相似性,但是也存在抗原处理上的不同,而且IF通常只涉及一种细胞类群,所以相对来说对特异性的要求就低一些,但是IHC切片上的细胞类群通常比较多,需要抗体精准地定位于一种细胞的特定部位,对抗体的特异性要求远远高于IF,所以还是有相当一部份抗体只能进行其中的一种实验,选购抗体时非万不得已不建议冒这个风险去尝试,实在没把握可以联系生产厂商看他们是否能进行一次实验。当购买抗体的使用目的不止一种实验时,更是要提前整理好自己的思路,尽可能选择那种可以满足所有的实验的抗体,否则很可能要针对同一抗原买多份抗体而造成经费上的不必要的浪费。

Species specificity/Species Reactivity 反应物种,即抗体可以和哪些物种来源的抗原识别。目前大多数公司生产的商品化抗体都是基于人源蛋白作为抗原的,但是考虑到人和其它动物的同源蛋白往往有比较高的相似性,所以很多抗体可以识别除了人之外的物种。显然,通常用重组蛋白作为免疫原比用多肽作为免疫原有更大的潜力识别其它的物种。对于购买者来说,如果要检测的抗原物种没有典型的代表性而且市场上找到不明确可以针对该物种蛋白的抗体,这时候就可以把目的蛋白的序列与抗体生产商提供的其它物种的抗体的抗原序列进行对比,如果相似度很高,那么是可以使用的。这里举个具体的例子吧。比如用户研究鸡的HSP70这个蛋白质,需要用抗鸡的HSP70的一抗,但是显然世界上很少有公司会专门为鸡的HSP70做一个抗体,因为研究的人实在太少了,而针对人的HSP70的抗体的供应商倒是非常多。 首先找到鸡的HSP70的蛋白序列:http://www.uniprot.org/uniprot/P08106 以及人的HSP70序列: http://www.uniprot.org/uniprot/P08106 , 另外找到Proteintech 公司有rabbit anti-human HSP70多抗: http://www.ptglab.com/Products/HSPA1A-Antibody-10995-1-AP.htm, 从该页面上得知抗原是重组人HSP70的C端350个氨基酸,那么将此350个氨基酸与鸡的HSP70进行序列比对,结果如下(DNAssist软件比对,Sequence 0是鸡HSP70, Sequence 1是人HSP70的C端350个氨基酸,红色部门表示相同的序列区域):

    由此图可以很清楚地看到,Proteintech的这份抗体用的免疫原与鸡的HSP70有极高的相似性,也就是说这份抗体有极大的可能性可以用于检测鸡HSP70!如果购买的时候不放心甚至可以咨询一下公司是否能有条件先检测一下。

Host/Source 宿主物种,即用来生产抗体的动物,对于多抗目前用得最多的就是兔子、羊、小鼠及大鼠,其它物种在“多抗制备动物免疫”一部份已有提及。 对于常用的一抗,通常都优先考虑兔子作为host,这是因为: 用兔子制备的抗体亲和力比较高(因为兔子与通常研究的特种在遗传上相差比较大,当然如果本来的目的就是研究兔源抗原那就是另当别论了),另外,相对于其它物种,兔抗中异嗜性抗体极少,也就是说直接与其它物种IgG生产反应的可能性较小,最后,商品化的抗兔二抗相当成熟,而且二抗的host选择余地也比较大,可以满足各种特殊的要求。对于单抗,Host则相对复杂一点,习惯上以最初提供能分泌抗体的淋巴细胞的动物视为Host,比如说,有人免疫大鼠,然后取大鼠脾脏与小鼠的骨髓瘤细胞融合,最后再在小鼠体内制备腹水而纯化出抗体,那么这时候Host不应该是用来制备腹水的小鼠,而且之前免疫用的大鼠了,这样得到的单抗俗称大鼠单抗。对于单抗来说选择host的余地就比较小了,现在主流做单抗的host就是小鼠和兔子,一般来说,能在市场上买到需要的单抗运气已经不错了, 对于host也没啥选择的余地。

Immunogen 免疫原,即用来制备抗体选用的抗原,偶联载体的多肽和重组蛋白是用得最多的免疫原,通常情况下,重组蛋白作为抗原得到的亲和力比多肽作为抗原得到的抗体的亲和力高,识别的表位多,即使抗原上大部份表位被掩盖或被破坏它们都能很好地识别,另外,用蛋白质作为抗原,得到的抗体识别其它物种的可能性也更高。但如果研究的对象是属于某一家族,而这些家族成员之间的相似性很高,那么只能选择偶联载体的多肽为抗原了。 其实免疫原是蛋白还是偶联的多肽更好,这个问题和前面提到的选择多抗还是单抗原则是一回事,这里就不再废话了。另外,关于抗原的更多基础知识可以参考本站的“抗原制备”一部份。

 Synonyms 别名, 很多抗原往往不止一个名字,不同的研究领域的人经常会对同一个蛋白质起上不同的名字,如上面提到的CD31又叫PECAM1, p53又叫TP53或Antigen NY-CO-13等,一般抗体公司都会尽可能地列全靶标的别名,对于搜索抗体的人来说别名其实是相当重要的,一是可以防止因名命不同造成的搜索遗漏,因为有时候用户使用的名字不一定是最常用的名字;另一方面,很多时候不同的抗原也会有相同的名字,而别名则可以作为确认产品的一个参考,比如MTCO2和PTGS2都有一个相同的别名COX2,当用户以COX2作关键字搜索的时候,则很容易出现选错抗体的情况,如果核对一下各自的别名,则就相当清楚了(这只是作个参考,更重要的是看GenBank accession number 和Full Name更权威)。

Isotype 抗体的亚型,这是单克隆抗体专有的名词(很多公司多抗页面上也有这一栏目,不过通常默认为IgG,其实是指广义的免疫球蛋白)。一般来说,单克隆抗体的亚型有:IgA, IgG1, IgG2a,IgG2b, IgG2c, IgG3, IgM,其中IgA, IgM, IgG是抗体的大类,IgG1,2a,2b,2c,3则是IgG的亚类。IgA类的单抗极罕见,IgG2c亚型的单抗也极少见,只有使用特殊的Host时才会见到。对于抗体生产商来说,不同的亚型的抗体需要用不同的方法来纯化,对于用户来说,大多数情况下亚型都是不需要考虑的,只是偶尔IgM亲和力相对弱一些。 另外,对于做IP的用户来说,如果用Protein A填料进行IP,那么尽量选用IgG2a和IgG2b亚型的抗体,尽量避免IgG1亚型的抗体,因为Protein A对IgG1的亲和力相对较弱,在IP体系中很可能出现不结合的现象,当然,如果抗体生产商已经证明过确实可以结合的就应该另当别论了。 还有,有些人需要做体外中和实验,这时候不妨考虑一下IgM,IgM是五聚体,上面有10个抗原结合位点,可以在液体环境里可以与抗原结合并且很容易形成巨大的网状复合物,以便放大信号。

Purification method 纯化方法, 对于多抗来说,主流的纯化应该是用抗原直接做亲和纯化了,即将抗原固相化,然后结合抗血清里的目的抗体,最后用洗脱液将目的抗体洗脱下来,这种方法也叫免疫层析, 其具体原理与操作参考本站“多抗纯化与保存”页面,用这种方法纯化得到的抗体绝大部份是针对目的抗原的抗体,因此效价高而且杂信号少。市场上有少部份公司采用Protein A/G来纯化多抗,建议慎重选择。 对于单抗来说,主要方法有Protein A,Protein G, Protein L亲和纯化,有嗜硫亲和纯化,有辛酸-硫酸铵两步沉淀法,有硫酸铵一步沉淀法,有优球蛋白沉淀法。显然一般的亲和纯化纯度都比沉淀法好,所以建议优先选择用亲和纯化的抗体。

Concentraion 抗体浓度, 一般实验中意义不大,只有在进行标记实验或IP时需要用到。

Recommend Dilution 推荐稀释度,厂家根据实验得出的稀释范围,一般来说,建议优先使用说明书上厂家提供实验结果时使用的稀释比作为起始尝试条件,然后根据信号的强弱作细微调整。

 Storage Condition and Buffer 保存条件与保存Buffer,主流的抗体保存条件基本都是-20度保存,也有极少数公司是放4度保存的。一般来说,抗体加甘油后放-20度保存四五十年是没什么问题的,但是放在4度的目前还不好说。需要注意的是,不管是哪一种保存方式,一定要按照抗体的说明书来保存,不同厂家生产的抗体保存条件都不一样,有的需要买回来重新溶解,有的需要进行分装再保存,有的则不建议分装(分装会有操作损失,而且抗体会被分装容器吸附走),另外,几乎所有的抗体都有一个大忌:反复冻融,每反复冻融一次,对抗体活性都会产生很大的影响,因此一定要防止反复冻融抗体。另外,也有人喜欢把稀释好的工作液放在冰箱里过一段时间再用的,这也非常不推荐,一般来讲,无论多么优秀的抗体稀释液,都不如抗原的原始保存条件好,而且稀释后抗体浓度本身就会下降,众所周知蛋白质浓度越低就越不利于保存,所以避免以工作液形式保存抗体。而且从另一方面讲,工作液长期放置还有长菌的风险。再说说保存buffer, 一般的抗体说明书都会明确提供缓冲液配方,有的公司为了技术保密不愿意透露保存缓冲液,一般情况下用户不必深究,但是进行特殊实验而不确定保存buffer是否有干扰时,一定要向厂家询问。另外有的用户需要将抗体进行标记,这时候尽量避免选择含有蛋白质作保护剂的抗体,否则大大影响标记效率。

Background/Description 产品背景介绍, 一般是供应商撰写或总结文献上关于靶抗原的介绍,必要时对产品独有的特性作描述说明,对用户使用产品和选择产品经常会有帮助,建议选购前认真阅读。

Price 价格,这也是不少人关心的问题,但是价格的比较也是有讲究的,很多人直接看包装的大小去计算是否划算,这是很不靠谱的,正确的计算方法应该是计算单位体积工作液所需要的费用,即单份抗体价格÷(抗体包装体积×稀释度),相信大家很容易理解,就不多说了。 另外,对于经费实在有困难的朋友来说,直接找找做相同课题的同仁索要也是一个不错的办法。

    最后,实在找不到商品化的抗体的时候,要么就自己动手制备,要么就外包给服务公司吧,其中要考虑的因素也同选择商品化抗体类似。

    接下来回到实验中来。

    一抗的稀释 上面说了,要尽量按照商家推荐的稀释比稀释,然后根据信号的强弱稍稍调整稀释度,这个基本上是没啥好说的,凡是有点WB常识的都知道这一点,需要指出的是,有些蛋白质在不同的组织中丰度极高,但在有的组织中有少,比如白蛋白在肝脏和血液中含量极高,但是在其它的组织中含量相对低许多,那么一抗的用量也应该适度提高。 再说说稀释液,很多人都很迷信一些厂家提供的一抗稀释液,其实没有那么神乎其神,稀释液基本就是基础buffer加惰性蛋白,基准buffer大多是PBST或TBST,个人觉得二者差别不大,至于惰性蛋白有钱的人家用BSA绝大部份情况下会用得很好,寒酸一点的用脱脂奶粉稀释也不会差,但是检测磷酸化的蛋白时,就需要避免使用奶粉做封闭液和抗体稀释液,这是因为牛奶中含有少量碱性磷酸酶,很有可能切掉已经磷酸化的蛋白上的磷酸基团,导致一抗不能识别抗原而产生阴性结果。

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