引物设计

PCR可以算得上是各生物实验室的标配技术了。无论是基因定量、克隆、组装、突变、测序……都离不开基于PCR的实验。目前,PCR相关试剂、耗材及仪器已经发展得相当成熟,包括聚合酶以及缓冲液的优化,使得扩增能力、保真度和兼容性均得到极大的提高。因此我们不再需要像过去一样,分散部分注意力用于摸索热循环条件、调整反应体系各底物的浓度等。也就是说,整个PCR实验条件,基本可以模板化,而不需每做一个实验都从头开始摸条件。

然而PCR实验中,有一个环节是厂家无法帮我们优化的,那便是引物设计。本文第一部分将以人EGFR基因为例,手把手教各位用最简单的方法,设计用于实时定量PCR研究基因表达水平的引物。在第二部分还会简单介绍,如何用相同的在线工具来评价引物。

(注:本文仅介绍的引物设计方法,仅适用于染料法qPCR之于基因表达定量研究,不涉及其他应用。像ORF克隆,没有特别的方法,就是老老实实在ORF一头一尾设计一对,用DNAStar lasergene等软件可以辅助设计,或者自己手动。而如果要做点突变、插入、删除,或者多片段组装,可以使用NEB相应的在线工具。)


第一部分:用Primer Blast设计引物

首先,上NCBI搜人CRTC1基因。

往下拉,可以看到这个基因可能存在2种转录本。(NM开头的就是mRNA,其他暂时别管)

    继续往下拉,找到各个转录本的具体信息,可以看到isoform 1和3共2个转录本。

    以isoform 3为例,点击NM_001098482.1那个超链接,进入下面这个页面。

    点击右方的Pick Primers,进入引物设计的Primer Blast页面。可以看到PCR Template那里已经帮你填好了。现在,其他地方暂时留空,把PCR product size的Max改成350。qPCR反应中,延伸时间一般不超过30 sec。按常规Taq酶的反应速度1 kb/min来计算,30 sec可以合成500 bp。但酶活性会随着反应时间的延长而下降,所以保守起见,将最大产物长度设为350 bp甚至更低比较合适。太短也不行,否则跟引物二聚体分不开,所以下限70不用改。如果硬是得不到什么合适的引物,那就把这个数字往上调,最好别超过500,要不然qPCR的反应条件就得改了(其实也就改延伸时间)。

    接下来,Exon junction span选项改为Primer must span an exon-exon junction。这里的意思是,至少有一条引物跨过了外显子之间的连接处。这样就算有基因组DNA污染了cDNA,也不会被扩增出来,保证定量准确。当然如果有的基因硬是没有内含子,改了这个选项就会报错。

    接下来的选项不用更改。Specificity check默认打钩,帮你跑引物特异性验证。Organism已经帮你自动填了人类(9606是Homo sapien的编号,你想研究其他物种,那就在一开始搜基因的时候搜对应的物种)。最后一行,如果你把钩打上的话,就会允许引物帮你扩增其他isoform(本例中就是isoform 1)。当然,这不代表着会把所有isoform一起扩增,或者说强制一起扩增。如果需要这么做,我们需要返回前面更改一下设置。这一点第一部分的末尾注明。

    点击Get Primers按钮,就会帮你设计引物了。由于是在线工具,请耐心等待几十秒。有时候人多,可能需要等几分钟。

    很快我们就会看到这个页面,返回了10对引物。按照前面的默认条件,这些引物的退火温度都在60℃左右。

    按照这个方法设计出来的引物,我做了那么多基因,成功率基本接近100%。这个在线工具的算法也在不断优化,按照近两三年的使用情况来看,没有遇到过失败的。(尤其是使用比较良心和稳定的试剂。在国内我是用天根,在美国是用原名biotool刚更名为bimake的试剂。好吧你说是软文我也懒得反驳,反正我就用这两家。这里也没有钦定的意思,我也用过Qiagen,Biorad和Thermo的,也能做得很好,但贵。)

    那如果要同时扩增isoform 1转录本,那怎么办呢?很简单,由于不同转录本之间同源性很强,基本上只有5’或者3’端有点差异,因此我们只需要指定引物落在所有转录本的共同区间就行了。

    回到刚开始的页面,我们可以看到另外一个转录本1。后面第4个以后的外显子(就是绿色的小竖线)是所有转录本都完全一致的。也就是说,我们只要让反向引物落在第4个外显子之后,就可以把所有2个转录本一起扩增出来了。

注意:XM开头的不是我们需要的,那些是预测的转录本。

    往下拉,这一例中我们可以随便点击任何一个转录本的NM那个超链接,比如还是isoform 3,进入同样的页面。但这次在点击Pick Primers之前,点击Highlight Sequence Features。

    然后你就会看到页面的底下变成了这个模样。我们把高亮的序列设置为exon(Feature左边),并高亮第4个外显子。目测一下,这个外显子从380位碱基开始。记下这个数字。

    回到上方,点击Pick Primers,并把正向引物的5’端边界设为380。注意,不是3’端边界。其他的选项,按照本文前面讲述的方法进行调整。然后点击Pick Primers按钮。

    此时傲娇的程序就会跳出来抗议说,你这样会P出其他的isoform。然而这就是我们要的结果。于是把所有的钩都选上。

    点击Submit,再耐心等一会,就能得到能够扩增所有isoform的引物了。

    我们可以看到,10个引物都是至少从第四个外显子后才出现的。

    如上图所示,这两个都是我们需要的!


  一道细细的红线(尼玛,明明是黑线,不要骗,我读书少)后,我们继续!

用Primer Blast评价引物

    有时候我们并不需要亲手设计引物,从文献或者数据库里面就可以找到。但在正式使用之前,我们可以利用Primer Blast来看看那些引物是否靠谱。

    这里顺带介绍一下几个常用的引物数据库:

RTPrimerDB:RTPrimerDB: the real-time PCR primer and probe database

PrimerBank:PrimerBank

qPrimerDepot:https://primerdepot.nci.nih.gov/

    具体如何使用就自己摸索了,都非常简单。

    现在同样以人CRTC1基因为例,我们从PrimerBank搜到一对引物。这时候,前面的方法还是一致的,但此时,把数据库的引物序列输入到Use my own forward/reverse primer那里就可以了。PCR product size那里可以不用改,保持默认。但请更改下方的Exon junction span的设置为同前文所述一般。

此时拉到最下面,点击Get Primers。由于我们要求引物必须跨过外显子的连接处,并且在Exon/Intron设置那里报错了,如果跨外显子,就会弹出结果页面;如果没有跨外显子,就提弹窗提示,然而我们着没有弹窗,直接显示了结果。这就代表,数据库的这一对引物并符合这一要求。

    当然,如果没有跨外显子,就会出现如下界面:

    有时候我们会发现,程序认为引物可能存在非特异扩增。这时候先别慌。如红框所示,如果非特异的引物-模板结合,在引物的3’端末尾最后两个碱基,存在至少一个错配的时候,非特异PCR反应就几乎不可能进行。(Template的点代表完美互补配对,显示的字母为错配碱基)

OK,引物设计就介绍到这了!

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