Cytoscape插件3：Enrichment Map(2)

材料和方法

1.微阵列数据分析

所有的微阵列表达数据下载与GEO数据库。Raw.CEL文件用bioconductor的affy包进行RMA。数据集的选择依据以下几个质量控制标准：可靠的并且高覆盖率的微阵列平台（Affymetrix HGU-133 plus 2.0），清晰的实验设计，重复足够数目（细胞系>=3,病人样本>=5）,统一的cell composition，PCA结果和实验设计已知（比如样品可以从不同类进行清晰分类）。在从Affymetrix 向NCBI entrez-gene转换后，执行富集分析，使用的是bioconductor hgu133plus2 package。

2.雌激素处理的乳腺癌细胞

微阵列数据（GSE11352）由18个samples组成，6classes，每个3个重复（6classes指的是3个时间点，雌激素处理和未处理）。这些系列由12和24小时时间点组成，GSEA进行分析，t-test，2000gene-set permutations。在case1和case2中，GM使用的富集阈值是：名义p-value<0.001,FDR<5%.overlap coefficient 设置为0.5

3.结肠癌早期

GSE4107,22个样本构成，10个normal，12个结肠癌。GSEA分析，t-test，2000gene-set permutations。EM的仅用nominal p-value<0.001,FDR<5%.重叠系数设置为0.5

4.基因集预处理gene-set pre-processing

GO注释从bioconductor下载，org.Hs.eg.db 包，为了GO注释覆盖最大，没有明显的代码进行过滤。Terms 注释超过500或少于10个基因的被丢弃，产生了2378个GO term用于分析。这些阈值是富集分析的常规应用，作为大的基因集传递有意义的生物学意义（比如生理过程的调节），然而，很少的基因集因为随机波动倾向于错误富集。同时，减少的基因集数目减少了多重检验校正的负担，潜在的增加了分析能力。

5.EM:重叠检测和网络可视化

基因集定义和富集列表文件在cytoscape插件EM中加载，并且通过显著性进行过滤，用户可以自行设置p-value和FDR阈值。显著性基因集之间的重叠overlap是根据Jaccard 系数或overlap系数计算的，这依赖于用户的选择。 假如有个基因集A和B，|X|等于基因集X中的元素的数目，Jaccard coefficient（JC）被定义为

image.png

而overlap 系数（OC）被定义为

image.png

当等级聚类组织的基因集集合（如GO）被分析时，CO更有优势。Parent-child重叠产生最大的得分，这意味着所有的等级关系都会在网络中呈现。另一方面，JC倾向于把相似size的基因集划为一组，因此，GO 父子关系经常在这种网络中缺失。基因集网络的产生的元素必须是用于设定的阈值之上的，不管是JC还是OC。并且以cytoscape force directed输出，权重mode。OC或JC定义了边的权重。

6 EM：应用

EM作为一个java插件免费在cytoscape网络中可视化和分析。插件和代码也是免费的。这个插件可以读取两种类型的输入格式，GSEA专有的和一般的。Case2中使用的热图可视化，可以对任何选定的基因集使用。任何用户选择的基因集和基因集集合都可以被上传并执行query set post-analysis，就像在case3中描述的。