专题目录
第1篇:ATAC-seq的背景介绍以及与ChIP-Seq的异同
学习目标
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Peak Calling
Peak calling即利用计算的方法找出ChIP-seq或ATAC-seq中reads富集的基因组区域。
如下图所示,比对结果的文件中reads在正负链不均匀分布,但在结合位点聚集。正负链5‘末端的reads各形成一组合,通过统计学的方法评估这些组合的分布并和对照组比较,确定这些结合位点是否是显著的。
NOTE:ChIP-seq的分析方法可以鉴定两种类型的富集模式:broad domains和narrow peaks。broad domains,如组蛋白修饰在整个基因body区域的分布;narrow peak,如转录因子的结合。narrow peak相对于broad 或者分散的marks更易被检测到。也有一些混合的结合图谱,如PolII包括narrow和broad信号。
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MACS2
peaks calling 有不同的方法,MACS2是最常用的call peaks工具。 MACS全称Model-based Analysis of ChIP-Seq,最初的设计是用来鉴定转录因子的结合位点,但是它也可以用于其他类型的富集方式测序。
MACS通过整合序列标签位置信息和方向信息提高结合位点的空间分辨率。MACS的工作流如下所示:
MACS2的使用方法
输入文件参数:
-t
:实验组,IP的数据文件c
: 对照组f
:指定输入文件的格式,默认是自动检测输入数据是什么格式,支持bam,sam,bed等g
:有效基因组大小,由于基因组序列的重复性,基因组实际可以mapping的大小小于原始的基因组。这个参数要根据实际物种计算基因组的有效大小。软件里也给出了几个默认的-g 值:hs -- 2.7e9表示人类的基因组有效大小(UCSC human hg18 assembly).输出文件参数:
--outdir
:输出结果的存储路径
-n
:输出文件名的前缀-B/--bdg
:输出bedgraph格式的文件,输出文件以NAME+'_treat_pileup.bdg' for treatment data, NAME+'_control_lambda.bdg' for local lambda values from control显示。peak calling 参数
-q/--qvalue
和 -p/--pvalue
q value默认值是0.05,与pvalue不能同时使用。--broad
peak有narrow peak和broad peak, 设置时可以call broad peak 的结果文件。--broad-cutoff
和pvalue、以及qvalue相似--nolambda
: 不要考虑在峰值候选区域的局部偏差/λq值与峰宽有一定的联系。理想情况下,如果放宽阈值,您将简单地获得更多的峰值,但是使用MACS2放松阈值也会导致更宽的峰值。
Shift 模型参数:
--nomodel
这个参数和extsize、shift是配套使用的,有这个参数才可以设置extsize和shift。--extsize
当设置了nomodel时,MACS会用--extsize
这个参数从5'->3'方向扩展reads修复fragments。比如说你的转录因子结合范围200bp,就设置这个参数是200。--shift
当设置了--nomodel,MACS用这个参数从5' 端移动剪切,然后用--extsize延伸,如果--shift是负值表示从3'端方向移动。建议ChIP-seq数据集这个值保持默认值为0,对于检测富集剪切位点如DNAsel数据集设置为EXTSIZE的一半。
示例:--nomodel --shift -100 --extsize 200
--nomodel --shift 37 --extsize 73
--call-summitsMACS利用此参数重新分析信号谱,解析每个peak中包含的subpeak。对相似的结合图谱,推荐使用此参数,当使用此参数时,输出的subpeak会有相同的peak边界,不同的绩点和peak summit poisitions.
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ATAC-Seq call peaks示例
对人细胞系ATAC-seq 数据call peak的参数设置如下:
macs2 callpeak -t H1hesc.final.bam -n sample --shift -100 --extsize 200 --nomodel -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2> sample.macs2.log
MACS2输出文件解读
Coordinates in XLS is 1-based which is different with BED format XLS里的坐标和bed格式的坐标还不一样,起始坐标需要减1才与narrowPeak的起始坐标一样。
Remove the beginning track line if you want to analyze it by other tools.???
summits.bed, narrowPeak, bdg, xls四种输出文件的比较
HBC的深度NGS数据分析课程 MCAS2文档