多序列比对，进化树分析，保守性，密码子偏好性分(1)
- 前言：假如类鼻疽杆菌中发现有一个感兴趣的gene，想查看此gene在各类鼻疽菌株甚至原核生物和真核生物中是否也表达此gene。若表达，各菌株之间序列差异大不大，进而看其保守型，密码子的使用是否有所偏好。
以BopA蛋白为例
第一部分：下载所需物种的BopA蛋白序列（多物种）
1下载query BopA蛋白序列
1.1 第一种方式
打开https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein，输入BopA，search
image1.png
然后直接复制，或Run BLAST,或send to
image2.png
image3.png
1.2 下载BopA蛋白序列:第二种方式
- 1 打开https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
- 2 输入BopA，search，结果中选中第一个k96243标准株
image4.png
- 3 点击下图中的GeneBank
image5.png
- 4 点击YP_111530.1或直接复制序列
image6.png
- 5 点击进入,Run BLAST。或复制序列。
image7.png
2 BLAST（nr protein sequeces database）
2.1 条件设置如下
image8.png
2.2 结果如下
image9.png
一般情况下，按下面这个步骤1234导出即可。
image10.png
但是现在这个情况，按上面这样是不可能的，因为完全看不出物种信息，做进化树没什么意义。
所以需要稍微麻烦一些，具体如下： 点击image9中的[Taxonomy reports]
image11.png
上图中的Accesion即为蛋白的登录号，左边中括号内为物种，可见非常多重复，继续往下看，可见
image12.png
- 可以看到物种及对应的accession ID，我们的目的是得到有物种名和蛋白序列的fasta文件。 对上图来说，只需要得到ACCESSION ID，再搜索一次protein database即可
- 需要注意的是，只需要得到每一个物种的第一个Accession ID
- 这些ID，应该可以用python爬取相应数据。但是假如你需要的物种少，可以直接复制这些ID。
- 假如需要几十甚至100多个物种，逐个复制粘贴会很麻烦，这里我采取excel来做，大概需要几分钟时间。 具体步骤为，excel导入数据-Organism Report部分-替换部分数据-分列-去重复。最终得到如图image14（部分）。
image13.png
image14.png
2.3 提取上述Accession ID的protein fasta序列
注意，NCBI一次提取不能超过100个accession ID，上述138，所以分两次提取
image15.png
或者
image16
最终得到下列文件
image17.png
下面可以进行进化树制作了，但是之前需要进行一下改变，那就是fasta文件说明部分只保留物种名即可，也就是说，只保留[ ]里面的内容。内容少的话可以手动编辑，我这里100多，所以用一个脚本进行。
$ awk -F '[][]' '{if ($0~/>/) {print ">"$2} else {print $0}}' BopAsequence.fasta > BopAoutput.fasta
$ less BopAoutput.fasta结果如下，这样就可以进行多序列比对及进化树分析了
image18.png
第二部分 多序列比对
MEGAX软件下载地址,安装
image19.png
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找到上面文件，打开
image21.png
默认参数，OK，多序列比对完成。下面site输入氨基酸位置可以选择查看自己想看的序列，保存文件。
第三部分进化树分析
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默认参数，关于gap和extention罚分方法，可以自行google。 物种太多，我选择环形展示。明显看出thailandensis，mallei，peudomallei在其中的分布，各自成一cluster。也就说BopA具有进化意义。
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