跟NBT一作学扩增子分析 | 2019微生物组—16S扩增子分析专题研讨论会第五期

在广大粉丝的期待下，《生信宝典》联合《宏基因组》在2019年7月19-21日北京推出《16S扩增子分析》专题培训第五期，为大家提供一条走进生信大门的捷径、为同行提供一个扩增子分析实战学习和交流的机会、助力学员真正理解分析原理和完成实战分析，独创四段式教学(3天集中授课+自行练习2周+集中讲解答疑+上课视频回看反复练习)，“教—练—答—用”四个环节统一协调，真正实现独立分析大数据。

关于学习生物信息学分析的重要性，请阅读《生物信息9天速成班—成为团队中不可或缺的人》。

课程简介

请详细阅读课程简介，如果以下内容您全精通，不必参加此培训。

本课程一共3天，每天6节课，共18节课，全部课程均理论与实战结合(只要课上讲的内容，都是要带你亲自实现的分析)。从分析平台搭建、Linux和R基础、图表解读和实战、扩增子分析标准流程、功能预测、统计分析以及各类高级分析(进化树、网络、环境因子、机器学习等)，和CNS级图片修改排版。3天时间，老司机带您完成自学需要3个月甚至是3年的崎岖之路，助力您真正玩转扩增子分析。

课程大纲

每节课1小时一个主题，理论结合实战，学懂原理，实战操作，全是老司机多年经验和代码的无私分享。下面是课程安排，如11代表第一天第一节课，26代表第二天第六节课，41为两周后的线上集中视频答疑。

教程内容简介如下：

一、生信基础知识和技巧

还在为没有Linux服务器而无法分析扩增子数据而苦恼吗？其实你的个人电脑就是扩增子分析的利器。易生信团队独创实现了跨平台的分析流程，在大家的Windows笔记本上可以轻松实现扩增子领域的绝大多数分析，第一节课带你轻松在自己的本本上搭建数据分析平台。

图1. 易生信首创基于Win10优化的扩增子分析流程，笔记本秒变大数据分析平台

推荐使用Windows10系统，8G及以上内存分析更流畅。 我们也会分享给大家在Linux上配置整个分析流程的代码 (Mac跟Linux类似，无须区别对待，但部分软件可能安装方式不同，未做深入测试，不建议参加培训时使用）。

同时讲解生物学家必要掌握的Shell和R语言基础知识，保证你高效、稳定的使用扩增子分析平台。

图2. Shell和R学习大纲，首创Rstuio中鼠标点击可完成Shell脚本和R语言分析，既打开生信的大门，又不会增加生物学家时间成本

二、图表解读和绘制

针对很多老师缺少系统的生信背景，看不懂分析文章图表，更对绘制各式图表手足无措。

我们推出过如下两个系列，共16篇原创文章，对8种图形进行讲解和R语言绘图。

• 扩增子图表解读-理解文章思路
• 扩增子统计绘图-冲击高分文章

但这些只是入门，在培训上，我们将结合发表高水平文章，进一步讲解16种常用分析图型结果的原理和使用范围，让您不仅读懂图，更知道如何应用于自己的研究，并亲自轻松完成绘图。

针对大家使用R语言绘图学习时间成本较高的问题，易生团队针对常用16种图开发了免费绘图网站，一键出图，更可鼠标点选参数修改图形的个性样式。

图3. 16种常用图形的绘制。可使用我们的在线绘图工具实现。

为了让各种统计图片实现出版级的组图，特开设了一节Adobe Illustrator修图排版课，讲述基本使用技巧，轻松掌握精髓，让你文章图版档次向CNS看齐，轻松成为实验室的修图和拼图达人。

图4. AI排版本子图为CNS出版级组图示例(Science, 2016封面文章)

三、扩增子基础和分析流程

图5. 典型的扩增子结构模型图

• 扩增子背景知识

1. 背景：国际微生物组(人类HMP、环境EMP)计划、中国微生物组计划
2. 研究对象：人、动物、植物、环境
3. 研究方法：培养组学、扩增子测序 (最常用)、宏基因组、宏转录组、宏蛋白组、宏代谢组、宏表观组等
4. 宏基因组学的研究热点：微生物多样性、宏基因组、培养组、肠菌与疾病、MWAS
5. 扩增子基本原理：细菌/古菌 16S、真菌18S/ITS结构、引物选择等
6. 实验设计：样品制备和建库中的误区
7. 文章套路：扩增子分析SCI文章的物种组成、功能预测常用套路
8. 主流方法优缺点比较：QIIME、QIIME2、mothur、Usearch-unois3、dada2等方法

• 扩增子分析流程

之前我们发布了基于QIIME(引用13000+)+USEARCH(引用8000+)组合的史上最详细中文扩增子分析流程，累计阅读10000+。

• 扩增子分析流程-把握分析细节

同时在去年也推出了2018年正式接档QIIME的最新流程QIIME2的官方中文帮助文档，累计阅读5万+。

• QIIME2中文教程-把握分析趋势

想使用QIIME和QIIME2的小伙伴可直接点击上方链接学习。课上也会带大家用服务器操作，分享最新私人定制流程。

但上面两种分析流程仍有很多缺点，如需要Linux服务器，安装和操作复杂，学习时间成本过高等不足。

易生信团队组织宏基因组、生信宝典的一线生信专家，为广大生物学家，定制了一套安装部署简单、鼠标点击编程、支持主流操作系统、学习成本低、又灵活的扩增子分析流程，助力生物学家轻松分析数据，更专注生物学现象的挖掘。

图6. 扩增子分析流程金字塔，数据量从下向上逐渐减少

• 扩增子流程如下：

1. 实验设计的编写
2. Illumina测序数据的质控：fastqc, mulitqc
3. 质控流程：双端序列合并、切除barcode和引物、质控
4. 生成OTU/ASV：序列去冗余、聚类clust_otu生成OTU或unoise3去噪生成ASV(Amplicon Sequence Variants)
5. OTU筛选：嵌合体生成原理及去除方法、去除线粒体、叶绿体和宿主非特异扩增污染、生成代表性序列和OTU表
6. 物种注释及进化树构建
7. 常用Alpha多样性指数计算
8. 常用Beta多样性距离矩阵计算

现在你可以在自己笔记本或台式机上轻松分析扩增子啦！并且支持最新的去噪生成ASV方法，想自己亲自分析的朋友，快来北京参加扩增子专题培训班吧！

图7. 常用宏基因组统计作图软件STAMP & LEfSe

引用过千次的STAMP绘制Extended barplot大家应该很常见，带你半小时速成。LEfSE引用超1700次，它的柱状图和圈图随处可见，但服务器超级难用，即上传痛苦，又要久等。我们为学员定制了国内专享服务器，随时为你服务。有服务器的伙伴还可以获得安装和使用的教程，在自己的服务器上可重复计算，不受网络和地域限制自己随时随地使用。

四、可重复计算和统计绘图

对于可重复计算要求比较高、对细节有进一步分析要求的学员，我们还会教大家当前最顶级的R语言统计分析框架，让你零基础轻松实现可重复计算，满足顶级文章的代码公开和网页可重复要求(这些资源在生信公司是价格几十万的绝密流程代码，一般人是没有机会见到的)。

图8. 数10种高质量图的R源代码实现可重复计算

在自己电脑上轻松修改输入文件、参数。可全程记录分析过程，保证从数据到发表级图形的可重复计算，让团队分析水平上升到大牛级别。

1. Alpha多样性各种指数：Shannon、Chao1、Observed OTU、PD whole tree等，并配合Anova，LSD统计；
2. Beta多样性各种距离矩阵：Bray Curtis、Jaccard、Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac等结果的树状图、箱线图、散点图展示样品间差异；并配合Adonis, Anosim, MRPP统计
3. 有监督的主坐标轴分析 (CCA/RDA)，展示组间差异，anova.cca统计
4. DESeq/edgeR/t.test/wilcoxon统计组间差异，计算Pvalue和FDR
5. 热图、曼哈顿图、火山图展示两组间比较差异分类单元、OTU/ASV
6. 韦恩图、三元图、网络图展示两组及多组间相同与不同

五、功能预测和机器学习

学习PICRUSt分析原理、常用结果展示样式及文章解读。实战进行官网、本地、在线分析，并对结果进行整理，方便STAMP、LEfSe以及R分析。下图为预测结果经STAMP快速分析的结果展示，学员可以在老师带领下35分钟内完成以上分析。

图9. 功能预测结果使用STAMP统计和可视化

对于不满足用KEGG功能预测和统计结果的小伙伴，我们还进一步讲解FAPROTAX (2016, Science)的分析，适合研究环境、元素循环的同行；此外还有BUGBASE分析，实现细菌代谢、厌氧性、革兰氏分类等表型预测，适合医学领域的同行使用。

图10. 重现两篇Nature文章机器学习分类和回归分析

上图：Wilck-2017-Nature，采用Adaboost进行分类和测试集验证准确率。 下图：Subramanian-2014-Nature，采用随机森进行回归、交叉验证、测试集检验模型准确率和热图展示特征OTUs时间序列变化。 高分文章离我们并不是遥不可及，在你的本本上，1个小时轻松重现每一个子图的分析和绘制。读懂这两类分析的结果。

六、网络和环境因子分析

图11. 两组网络比较、以及网络属性比较(Wang-2018-Gut)

还以为随便画个网络就能当文章的主图吗？这个时代早已成为历史。现在的高分文章，至少要求多网络比较，标配网络属性比较。在这里有微生物所微生物网络研究方向的博士，带你进入网络的世界，四步走实现即美观又有意义的网络分析：读懂网络——绘制单个网络——绘制多个网络——网络属性比较及可视化。这么前沿的技术，估计世界范围内只有这里会教你。

图12. 环境因子分析(Metcalf-2016-Science)

环境因子分析是很多研究的标配，常用的Vegan包引用过万次就知道它的重要性。但平时看到的图不是低分文章，就是不够美观。易生信团队精选Rob Knight团队2016年Science杂志中经典环境因子分析为例，让你的分析和可视化一步到位，向CNS看齐。