Burkholderia pseudomallei中的VI型分泌系统

题目：

通过体内表达技术鉴定了在巨噬细胞入侵伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）时诱导的VI型分泌系统

Introduction

类鼻疽（Melioidosis）是由Burkholderia pseudomallei（BP)引起的任何感染性疾病的通称。bp是革兰氏阴性菌，存于潮湿的土壤和污染的水中，尤其在东南亚和澳大利亚北部较多。主要经由污染的突然和水接触破损皮肤获得，在雨季和季风季节的发病率最高。另一个重要的感染途径是吸入污染颗粒。类鼻疽的临床表征包括从急性爆发性败血症到慢性局部感染等，通常影响到肺部，并且有脓肿特征。目前没有可用的疫苗，并且因为bp对多种抗生素具有内在高抗性，所以类鼻疽患者的总死亡率达50%。

类鼻疽的某些特征表明bp是兼性细胞内病原体，这些包括长时间的潜伏期（最近的研究病历表明，这个时间可能长达62年），复发（由于持续性原发感染的复发），以及在得病期间的细胞免疫应答的激活。与此一致，已经证明bp在非吞噬细胞，巨噬细胞和自由生活的变形虫重可以生存和繁殖。一旦它进入细胞内区域，B.pseudomallei能够从内吞空泡中逃逸并在细胞质内移动并通过诱导肌动蛋白重排进入邻近细胞，导致肌动蛋白尾部和膜突起的形成。对于很多细菌病原体，进入或在真核细胞内生存依赖于其功能性的III型或IV型分泌系统（T3SS或T4SS）。bp基因组具有编码从T3SS1-T3SS3三种T3SS的潜力。T3SS-3（也成为Bsa或动物病原体样T3SS）的组分与肠道沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌Inv/Spa/Prg具有同源性，其失活会导致真核细胞内的侵袭和存活受损，无法逃脱内吞空泡并且不能产生膜突起和激动蛋白尾。另一个基因bimA最近已经正式是bp基于细胞内激动蛋白的运动所必须的。对于BALB/c小鼠和叙利亚仓鼠中的Mallei克隆的完全毒力以及J774.2巨噬细胞样细胞系中的细胞内存活，也需要T3SS-3。

已经有几种方法可以用来鉴定细菌病原体中的体内诱导基因，包括STM（信号标签突变技术),IVET(体内 表达技术）。IVET使用基因表达策略研究细菌对宿主环境的反应，分析细菌在宿主体内（包括细胞内）的基因表达，也就是说可以选择在感染期转录诱导的基因。在对原始方法的改进中，避免了对特定营养缺陷型菌株的需求，在感染模型中用抗生素作用于与氯霉素乙酰转移酶cat基因融合的共整合菌株。这种方法也证明可以用于鉴定培养的巨噬细胞中表达的细菌基因，而这依赖于氯霉素可以穿透哺乳动物细胞的事实。与最近确定的bp菌株K96243的基因组序列相结合，这些技术对深入了解bp的毒力机制提供了有力的工具。

除了T3SS-3的作用之外，对于bp在细胞内存活的分子机制几乎一无所知。 本研究的目的是使用基于IVET的方法来鉴定可能有助于该bp在细胞内存活的基因。 我们的结果表明，至少一种VI型分泌系统（T6SS）基因簇以及至少两种不同金属离子获取系统的基因在巨噬细胞摄取后被诱导。

Methods

菌株，media和growth conditions

• bp10274，从来自瑛姑伦敦的致命的人类类鼻疽病例的血液中分离。
• 大肠杆菌CC118（lpir）用于维持可移动的R6K衍生的复制子，例如pGSTp，pSHAFT，pZINT2及其衍生物。
• 大肠杆菌BW19851用于将R6K衍生的质粒动员到bp中。
• 大肠杆菌菌株在Luria-Bertani（LB）培养基中生长，并且B.pseudomallei在BHIB中生长。

最低抑菌浓度的确定

通过双重稀释法在固体培养基中测定抗生素阿米卡星，庆大霉素，卡那霉素，奈替米星，链霉素，teico- planin和万古霉素的最小抑制浓度（MIC）。 对于所有抗生素，抗生素浓度范围为1mg / ml至256mg / ml，MIC记录为杀死琼脂平板上所有细菌的最小抗生素浓度。

入侵试验

将RAW264.7（美国典型培养物保藏中心）细胞系维持在含有10％胎牛血清和1mM丙酮酸钠的Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM; Gibco）中，37度的5％二氧化碳培养箱。在进行侵袭测定的前一天，将细胞接种在24孔组织培养板中至每孔10，000或100，000个细胞。 bp在37度10ml BHIB中静置生长过夜。然后将培养物在10ml BHIB中1:20稀释，并在37度下生长4小时。根据Elsinghorst（1994）进行侵袭测定，稍作修改。将来自4小时肉汤培养物的细菌以5000g离心10分钟并重悬于1ml PBS中。然后将细菌离心并重悬于1ml DMEM中。用25ml细菌悬浮液（~107个细胞）感染单层细胞，并在37度和5％二氧化碳下孵育2小时。用DMEM洗涤单层，然后在含有阿米卡星和卡那霉素（每个500mg ml21）的1.5ml DMEM中再维持2小时以杀死任何细胞外细菌。然后用1％皂苷裂解单层细胞以释放细胞内细菌。通过将连续稀释液铺板到血琼脂平板上来定量初始接种物和细胞内细菌。

细胞内生长测定

细胞内生长测定的方法同入侵实验，不同之处在于用阿米卡星和卡那霉素杀死细胞外细菌后，用PBS洗涤单层细胞，然后与含有头孢他啶（200mg/ml）的1.5ml DMEM孵育过夜。 裂解RAW264.7细胞，并在感染单层后4和24小时定量回收的细菌。

质粒构建

IVET载体pGSTp含有无启动子的氯霉素抗性基因（cat）和甲氧苄啶抗性（TpR）基因，作为在bp中选择的标记。通过缺失转座酶基因和mini-Tn5Tp的I末端，从pUTmini-Tn5TplacZYA构建整合的lacZ转录融合载体pZINT2 [以前的pUTmini-Tn5TplacZYADBDK]。 构建细节将另外报道。 通过在pZINT2中位于无启动子lacZ基因上游的SalI和XbaI位点之间插入含有tssH-5的39末端和tssI-5的59末端的约600bp XhoI-XbaI DNA片段构建pGS501。