骨髓基质在正常和白血病个体中的细胞图谱|Cell,Nature联袂解析

文章解读：Tiger

文章校对：生信宝典

研究背景

基质细胞是几乎每个器官中都存在的定义不明确的非实质成分，在器官发育，体内平衡和修复中起关键作用。对骨髓基质的研究已经确定了干细胞生态位中的基质细胞的细胞亚型，其调节造血再生并且能够引发白血病。在这里，我们使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）来定义小鼠骨髓基质的细胞分类和由恶性肿瘤引起的基质变化。我们鉴定了17个表达不同造血调节基因的基质亚群，包括新的成纤维细胞和成骨细胞亚群，构建了不同的成骨细胞分化轨迹。新发的急性髓性白血病损害了间充质成骨分化并导致正常造血所必需的调节分子减少。这些数据表明，组织基质通过干扰正常实质细胞而对恶性细胞发起响应。我们对基质细胞的分类进行了全面解析，也发现了特定基质细胞可以与癌细胞进行互作进而损害正常组织。

研究方案

Sample: 非造血的骨髓细胞，分别取C57BL/6 mice, leukemic mice (造模)（很有趣的是我正文没有看见细胞数！）

单细胞建库流程：典型10X Genomics（如下图）

测序数据分析介绍

1. 工具: Chromium Single Cell 3’ V2 Reagent Kit;
2. 比对: Mouse genome, version mm10；excluded cells with fewer than 500 detected genes;
3. 降维：Seurat package， 表达矩阵→归一化→挑选高变化表达的基因 （剔除cell-cycle，ribosomal protein,and mitochondrial genes）→PCA分析→使用top 50 (elbow算法) PCA进行细胞分群；
4. 细胞分群和展示：graph cluster+t-SNE;
5. 增殖状态的评估：作者引用一篇文献 (Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells. Genome Res. 25, 1860–1872.)中涉及cell-cycle的gene set，计算每个细胞中这些基因的平均表达 (transcripts per 10K transcripts)作为增殖状态的表示；
6. GSEA分析；一文掌握GSEA，超详细教程
7. 随机森林分类器：训练随机森林分类器，预测cluster;

结果分析

(1) 骨髓基质细胞的scRNA-Seq识别六种不同的细胞群及其分化关系;作者对14只C57BL/6小鼠的非造血骨髓细胞进行单细胞测序；分别为：1）多能间充质干细胞 （MSC）（cluster1，表达Lepr）和Cxcl12; 2) 两个骨系细胞（OLC）亚群（cluster7和8，表达骨钙素[Bglap]）；3）四个软骨细胞亚群（cluster2,10,13和17;表达软骨细胞标记物，聚集蛋白聚糖[Acan]）和Col2a1; 4）5个成纤维细胞亚群（cluster3,5,9,15和16;表达成纤维细胞特异性蛋白-1 [S100a4]）; 5）三个骨髓派生的内皮细胞BMEC子集（cluster0,6和11;表达泛内皮标记Ve-cadherin [Cdh5]）;6）周细胞（cluster12，表达α平滑肌肌动蛋白[Acta2]）; 7）cluster4和8，表达软骨细胞，成骨细胞和成纤维细胞的标记。流式分选MSC和BMEC，标记BMEC（CD31，Sca-1（Ly6a），CD34，Cdh5）或MSC（CD106）。

(2) Lepr-MSCs通过产生HSC调节因子跨越连续分化状态并分成细胞亚群；骨髓中MSCs的主流模型是多能干细胞，可分化为骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞，但它们的确切身份仍不清楚。作者将cluster1定义为具有前脂肪细胞特征的Lepr +间充质基质细胞（Lepr-MSC）。作者定义该细胞亚群的重要身份是通过其他细胞的特异性marker在该种细胞的泛表达。在Lepr-MSCs中，作者区分了四个主要子集（LeprMSC-1-4），一个子集（Lepr-MSC-4）具有OLC特异性关键功能基因Sp7（osterix）和Alpl的表达，表明其正向成骨细胞进行分化，也支持了Lepr-MSC和OLC-1在分化轨迹方面的连续转化。

(3) 推断的谱系关系表明两个不同分OLC亚群的不同起源和不同的造血支持潜力 (Hematopoietic Support Potential);为了进一步的分析骨系分化，作者将重点放在了Lepr-MSC-4，OLC-1,OLC-2 3个细胞群。三个clusters都可以表达控制MSCs向OLCs分化的重要转录因子Runx2；OLC-1,OLC-2 进一步表达Sp7，都是骨谱系分化的重要因子；然后作者发现OLC-1cluster在成骨细胞状态中存在连续性，并且作者发现在不同时序下gene 表达情况不同；作者在OLC-2 cluster（几乎均为bone orgin）中观察到其有3种类型细胞组成，包括骨祖细胞、骨细胞和软骨细胞；但只有OLC-1细胞表达造血调控因子，说明两种OLC不同的分化来源和不同的造血潜能。

(4) 后绪作者分别对软骨细胞，肌成纤维细胞，BMEC和周细胞分别进行了分类；发现肌成纤维细胞和周细胞的某些亚群可以调控造血系统；

(5) 白血病中小鼠骨髓基质细胞比例发生重塑；作者检测到白血病细胞亚群比例的显着变化，并且呈现的是一种“coupled effect”，其中（OLC-1增加，OLC-2减少），BMECs（sBMEC减少，cluster6 aBMEC增加），软骨细胞（cluster2增加，cluster4减少）和成纤维细胞（成纤维细胞-5s减少，成纤维细胞-2s增加）；该种shift与之前的报道是相同的，在白血病患者中可以发生血管重塑，并且损伤骨形成，生长缺陷。

(6) 白血病在Lepr-MSCs和OLCs中损伤了成骨和成脂的分化途径并且白血病广泛的损伤了正常造血系统的调控基因的表达；

临床意义

（1）基质细胞分型可以更清晰，更一致地定义特定基质细胞对体内平衡和异常造血功能的影响，并为血液系统疾病中的基质靶向治疗奠定基础；

（2）为肿瘤进化提供了实验证据，其中实质和基质元素之间的交叉通信可能影响癌症的出现。

单细胞文章点评

该篇文章的亮点在于利用单细胞测序技术对骨髓中的stroma进行分类并对其在正常机体和白血病中所发挥的作用进行阐释；

但是，这篇文章所利用的单细胞的分析方法几乎是最为简单的分析流程，并且作者并不强调其测序细胞数的多少（图例中的细胞数吓死人），在software中几乎只用到了seurat和Scanpy；

其实看到这篇文章的第一反应，是我想到了另外一篇文章，Nature于2019.05发表的文章《The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.》该篇文章对骨髓中的成骨细胞，血管细胞等在正常和应激情况下进行比较分析；

同时，我们发现最近有关基质细胞的异质性的单细胞文献也是比较多的，这可能与先期实验捕获有关，上皮细胞的捕获数量往往没有基质细胞多，也由于基质细胞几乎无处不在，作用在传统意义上有许多的未知；（建议如果你的脏器当中主成分是上皮细胞的话，不要按照流程处理，去看看文献；如果你做的是全脏器的单细胞图谱，建议先取胰腺）

我更想说的是，这是一篇标准的单细胞图谱的构建过程，其实有一点怀疑这篇文章发到Cell的亮点在哪里，看来图谱类的单细胞还没有做完吧。。。

这篇文章描述的很细致，这也是单细胞文章的特点吧。分析部分分完群后更多的是定制性你选择关注的信息，进行针对性描述。

自己会分析还是比较关键的，不然看到有意义的结果都不能下手去筛选，欢迎来易生信单细胞培训 (www.ehbio.com/Training，或搜索引擎搜索关键字 易生信。)了解更多信息。

参考文献

Baryawno N, Przybylski D, Kowalczyk MS, Kfoury Y, Severe N, Gustafsson K,Kokkaliaris KD, Mercier F, Tabaka M, Hofree M, Dionne D, Papazian A, Lee D,Ashenberg O, Subramanian A, Vaishnav ED, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, Scadden DT.A Cellular Taxonomy of the Bone Marrow Stroma in Homeostasis and Leukemia. Cell. 2019 May 9. pii: S0092-8674(19)30459-3. doi: 10.1016

文末彩蛋

哈哈哈，就是解析Nature这篇于2019.05发表的文章《The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.》

研究背景

骨髓微环境在调节造血功能中具有关键作用，但其分子复杂性和对应激的反应尚未完全了解。作者通过单细胞测序在体内平衡和应激诱导的造血条件下绘制小鼠骨髓血管，血管周围和成骨细胞群的转录图谱。该分析揭示了骨髓生态位中先前未被认可的细胞异质性水平和解决了造血生长因子、趋化因子和膜结合配体的细胞来源问题。研究表明，在应激条件下，生态位元素的转录重塑，包括血管周围细胞向脂肪细胞发展。在应激诱导的变化中，我们观察到血管Notch delta样配体（由Dll1和Dll4编码）被下调。在没有血管Dll4的情况下，造血干细胞过早地诱导了髓样转录程序。这些发现改进了我们对骨髓生态位细胞结构的理解，揭示了对应激高度敏感的动态和异质分子图谱，并说明了单细胞转录组数据在评估离散生态亚群对造血功能的调节中的效用。

研究方案

Sample:一共17374个细胞，共构建了三种敲入reporter的小鼠进行标记，VE-Cad–tdTo-mato标记脉管类细胞、LEPR–tdTomato标记LEPR+阳性的细胞、COL2.3–tdTomato 标记成骨细胞 ；

单细胞建库流程：应用的是SMARTA-seq,建库流程如下：

测序数据分析介绍

1. 工具:SMART-seq v4 ;
2. 比对:mouse:genome (mm10/GRCm38)using STAR alinger;少于1000个gene的细胞，2%离群细胞被剔除；
3. 降维：Seurat package， 先通过CCA对数据进行整合，表达矩阵→归一化→PCA分析，top40 PCA用于后续分析;
4. 细胞分类和展示：tSNE;
5. 构建细胞发育轨迹：Monocle package;

结果展示

临床意义

1.将造血因子与其细胞来源相匹配，并显示血管 - 内皮细胞表达的Notch配体DLL4的缺失使骨髓造血倾向于HSPC的显着转录重编程；

2.靶向生态位相关因子可能干扰疾病的发生和发展;

有兴趣的就去读全文吧！

参考文献

Tikhonova AN, Dolgalev I, Hu H, Sivaraj KK, Hoxha E, Cuesta-Domínguez Á, PinhoS, AkhmetzyanovaI, Gao J, Witkowski M, Guillamot M, Gutkin MC, Zhang Y, MarierC, Diefenbach C, Kousteni S, Heguy A, Zhong H, Fooksman DR, Butler JM, Economides A, Frenette PS, Adams RH, Satija R, Tsirigos A, Aifantis I. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019 May;569(7755):222-228.doi: 10.1038