癌中之王：基质微环境塑造胰腺癌瘤内结构|Cell

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文章解读：Tiger

文章校对：生信宝典

Summary:

Single-cell technologies have described heterogeneity across tissues, but the spatial distribution and forces that drive single-cell phenotypes have not been well defined. Combining single-cell RNA and protein analytics in studying the role of stromal cancer-associated fibroblasts (CAFs) in modulating heterogeneity in pancreatic cancer (pancreatic ductal adenocarcinoma [PDAC]) model systems, we have identified significant single-cell population shifts toward invasive epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and proliferative (PRO) phenotypes linked with mitogen-activated protein kinase (MAPK) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling. Using high-content digital imaging of RNA in situ hybridization in 195 PDAC tumors, we quantified these EMT and PRO subpopulations in 319,626 individual cancer cells that can be classified within the context of distinct tumor gland “units” Tumor gland typing provided an additional layer of intratumoral heterogeneity that was associated with differences in stromal abundance and clinical outcomes. This demonstrates the impact of the stroma in shaping tumor architecture by altering inherent patterns of tumor glands in human PDAC.

研究背景

单细胞技术可以描述不同组织之间的异质性，但驱动单细胞表型的空间分布和条件是不太相同的。结合单细胞转录组和蛋白组学研究间质癌相关成纤维细胞（CAFs）在调节胰腺癌（胰腺导管腺癌[PDAC]）模型系统异质性中的作用，作者发现了明显的细胞群体之间的转化，包括：侵袭性上皮-间质的转化（EMT）和增殖（PRO）与丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路和信号转导转录激活子3 （STAT3）信号通路有关。作者在195个PDAC肿瘤中使用高内涵数字成像观察RNA的原位杂交，在319,626个个体癌细胞中对EMT和PRO亚群进行定量。肿瘤腺体分型提供了更为详细的肿瘤内异质性分型，且该分型与基质丰度和临床结果的差异有关。这证明了基质通过改变人PDAC中肿瘤腺体的固有模式来改变肿瘤结构的影响。

研究方案

Sample: 92 PDAC and 92 CAF cells across conditons;

作者分别用已经经过荧光标记的细胞系GFP-荧光素酶胰腺癌细胞系（PDAC-3）和mCherry CAF细胞系（CAF-1）以不同的比例（100:0,50:50,30:70,10:90）进行共孵育（实验设计真是值得学习，说实话我们如果设计该实验时，应该不会设计10:90这个比例，总感觉CAF细胞太多可能会影响胰腺癌细胞与CAF细胞之间的互作。。。）；

单细胞建库流程：SMART-Seq

测序数据分析介绍

1. 工具: SMARTer Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing-v3 kit;
2. 比对: hg38 genome(GRCh38.79) using the STAR v2.4.0h alinger with default settings.
3. 筛选：Genes with fewer than 10 reads in fewer than 5 samples were excluded from analysis, as were samples with fewer than 7000 genes with 5 or more reads.
4. 基因差异分析：作者并没有利用单细胞的分析流程，直接进行了转录组的差异分析（DESeq2）;(从作者的描述语言中，哈哈其实可以看出作者并不擅长生物信息分析，所以写的都比较“详细” （写的其实不太规范化），可能有人会觉得是不是测序深度较深所以作者应用了DESeq2进行差异分析，也可能是这样的，哈哈哈，但我不信。生信宝典注：方法描述还是挺细致的，参数和原理的都有描述，用的DESeq2是作者优化后的，说作者不擅长生信分析是有些误解。 通讯作者Martin J. Aryee是统计学、表观研究方向的，生信分析经验应该比较多。只是有一点在转录组分析中不太常用,未见作者的解释：Duplicate reads were marked using the MarkDuplicates tool in picard-tools-1.8.4 and were removed.）
5. 基因富集分析：Gene set enrichment analysis using Broad Institute MsigDB v5.0;

结果分析

(1) 与PDAC细胞共培养的CAF细胞导致患者衍生的PDAC细胞系中EMT和PRO表型的单细胞转录异质性;为了理解基质微环境对PDAC细胞转录程序的影响，作者利用GFP-荧光素酶胰腺癌细胞系（PDAC-3）和mCherry CAF细胞系（CAF-1）来分离每种细胞；以不同比例（50:50,30:70和10:90 PDAC:CAF）共培养PDAC细胞和CAF 72h后，进行scRNA-seq测序；作者发现一组186个差异表达的基因，51个基因下调 (PDAC only)，而135个基因响应于CAF共培养而上调 (PDAC:VAF=10:90)。GSEA分析发现这些基因集富集在PRO (HALLMARKE2F_TARGETS) 和EMT (HALLMARK EPITHELIAL_ MESENCHYMAL _TRANSITION)通路，其代表性基因表达如图C；作者发现在共培养条件为10:90的PDAC:CAF条件中存在PRO和EMT（DP，双阳性）表型的癌细胞亚群；在没有CAFs的情况下，65％的PDAC细胞是PRO、EMT双阴性（DN）表型，而在50:50的PDAC:CAF共培养条件下，PDAC细胞从这种DN状态转变为PRO，EMT单阳性或双阳性细胞的混合物；将100%CAFs与50:50 PDAC：CAF条件下进行差异分析产生3,059个差异表达基因（FDR <0.2），其中2,158个基因上调，901个基因下调。其中，PDAC细胞上调的基因富集在增殖功能的相关通路上，CAF细胞上调基因特异性富集在炎性干扰素反应相关通路。（其实炎性的间质细胞并不是特别新的东西，但利用单细胞层面对肿瘤细胞的炎症环境进行分析是一个既相对简单又重要的研究课题）

MET和PRO定义：The genes used for the Proliferation (Pro) and EMT meta-signatures were chosen as the 15 genes from the HALLMARK_E2F_TARGETS and HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL _TRANSITION gene sets that had the most negative median correlation with genes of the other gene set. Meta-signature scores for each cell were calculated as the mean expression rank for the 15 genes that comprise the given meta-signature.（常用表征方式，值得学习和借鉴）

(2) CAF条件培养基（CAF-CM）（其实就是CAF分泌的因子）对不同的PDAC细胞系的PRO和EMT表型的影响;作者发现在三种不同的CAF-CM中均发现了相对较高的PRO和EMT表型的细胞，并且作者在免疫缺陷小鼠中注射入不同比例PDAC-3和CAF细胞组成的胰腺原位肿瘤，并使用体内荧光素酶成像进行体内观察，发现10:90 PDAC：CAF肿瘤中原发肿瘤生长明显更快（4周时与对照组相比大7.9 3），但在30:70 PDAC：CAF中没有肿瘤；与单独的PDAC细胞相比，在PDAC：CAF原位肿瘤中观察到增加的转移性肿瘤负荷。（作者只是想说明基质的变化将会导致肿瘤转录发生变化，导致增殖能力和转移能力明显增加）

(3) CAF-CM激活不同PDAC细胞系的DP细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），并激活信号转导子和转录激活子3 （STAT3）信号通路;鉴于在CAF-CM存在下PDAC细胞向EMT和PRO表型转变，作者想要鉴定由于CAF-CM暴露而在PDAC细胞中激活的途径中的信号。在5分钟，15分钟，1小时，3小时和24小时对暴露于CAF-CM的PDAC-3细胞进行基于时程且基于质谱的磷酸化蛋白质组学实验。该实验揭示了EMT和PRO蛋白质网络的显着富集，包括MAPK途径的早期活化（MEK / ERK）随后在24小时有关STAT3通路的基因表达上调（STAT3）。

(4)CAF分泌的转化生长因子b（TGF-β）驱动PDAC细胞系中的DP表型;作者对无血清CAF-CM和无血清PDAC-CM进行了质谱分析并比较了CAF和PDAC分泌蛋白组学，发现TGF-β1是PDAC细胞系中增殖能力获得的重要贡献者。并且作者利用RNA-ISH确定了在原发性PDAC肿瘤中的EMT和PRO的表型；

(5) 基质含量与人原发性PDAC肿瘤中肿瘤腺体的不同模式相关;不同细胞类型（DP，EMT，PRO和DN）对患者预后结果的影响是不同的，同时也表明存在不同的肿瘤腺体类型。作者根据其肿瘤腺体细胞组成定义了8种不同类型的肿瘤腺体并且发现人类PDAC肿瘤中基质含量与腺体异质性确实存在相关性。作者观察到不同基质含量下含有不同细胞类型（DP，EMT或PRO）的腺体类型的富集：DP腺体（I型）仅在高基质肿瘤中富集，中基质肿瘤中EMT腺体（II型和IV型）低基质肿瘤PRO腺体（III型）中显着富集。并且作者发现发现肿瘤主要含有DP或EMT细胞的腺体（I型，II型，和IV）与恶化的患者生存率显着相关。

单细胞文章点评

该篇文章总感觉不是通过单细胞测序筛选出的调控基因的up和down，作者很有可能是做完了后面的实验后发现利用单细胞测序可以帮助文章提高档次，所以就利用了单细胞测序；

作者没有利用单细胞的分析思路，只是利用了普通转录组的基因差异分析；（其实，如果你细看Cell Immunity的文章的话，你会发现大部分都是这样的，单细胞分析确实可以帮助提高档次）

作者的设计实验的思路是值得好好学习的，尤其是在以不同比例的肿瘤细胞和间质细胞混合后查看差异分析，用这样的方法，多数的肿瘤其实都是值得做一做的；（比如肺癌与其间质细胞的关系，甚至可以做肺癌-间质细胞-炎症的关系，或者有许多其他腺癌，肺中的间质细胞类型较多）

在应用单细胞测序时，最重要的就是实验设计，不要等到已经做完测序N多钱投了出去，发现实验设计有问题。当实验设计不合理的时候，为了充分利用数据，我们总会想到去分新亚群，当往往找出的亚群没有实质意义，不是和代谢有关，就是和分裂有关，没有特异性功能方面的作用。（劝大家不要总抱着找新亚群的想法，要去找同一群里的不同细胞的异质性）

这篇文章其实也是通过模拟肿瘤环境来找部分分子功能的，我忽然想起了一篇设计简单，但很有趣的文章，大家可以看一看！这篇文章是耶鲁大学吴殿青组在Developmental Cell上发表的文章，题目是 《Leukocyte cytoskeleton polarization is initiated by plasma membrane curvature from cell attachment 》

参考文献

Ligorio M, Sil S, Malagon-Lopez J, Nieman LT, Misale S, Di Pilato M, Ebright RY, Karabacak MN, Kulkarni AS, Liu A, Vincent Jordan N, Franses JW, Philipp J, Kreuzer J, Desai N, Arora KS, Rajurkar M, Horwitz E, Neyaz A, Tai E, Magnus NKC, Vo KD, Yashaswini CN, Marangoni F, Boukhali M, Fatherree JP, Damon LJ, Xega K, Desai R, Choz M, Bersani F, Langenbucher A, Thapar V, Morris R, Wellner UF,Schilling O, Lawrence MS, Liss AS, Rivera MN, Deshpande V, Benes CH, Maheswaran
S, Haber DA, Fernandez-Del-Castillo C, Ferrone CR, Haas W, Aryee MJ, Ting DT.Stromal Microenvironment Shapes the Intratumoral Architecture of Pancreatic Cancer. Cell. 2019 May 23. pii: S0092-8674(19)30510-0. doi:10.1016