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医学科研实验基础知识笔记(三):细胞周期检测

一.细胞周期概述

细胞周期(cell cycle) 是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。 细胞周期是细胞生命活动的基本过程, 细胞在周期时相的变迁过程中进入增殖、 分化、 衰老和死亡等生理状态。

体外研究发现, 大多数细胞的细胞周期为 10 到 48 小时。 主要分为 4 期:

G1 期——DNA 合成前期, 是细胞周期的关键步骤。 细胞周期长短决定于 G1 期长度;

S 期——DNA 合成期;

G2 期——DNA 合成后期;

M 期——有丝分裂期。 M 期一结束, 2 个子代细胞就形成了。 这也标志着这一轮细胞周期的结束。

有些情况下, 也会把细胞周期分为 5 期。 在这种分类过程中, G1 期、 S 期、 G2 期和 M 期是相同的, 但是会增加一个 G0 期。 G0 期指的是某些细胞或某个阶段的细胞, 可从 G1 期退出细胞周期, 但是仍然存活。 这类细胞受某种刺激后仍能进入细胞周期, 继续进行 DNA 复制, 并进行有丝分裂, 这一时期被称为 G0 期。

在细胞周期的全过程中, 还有两个检查点(check-point) 。 这两个检查点分别是 G1/S期检查点和 G2/M 期检查点。 1) G1/S 期检查点, 控制着细胞从静止状态进入 DNA 合成期的调控; 2) G2/M 检查点的作用是: 决定细胞是否一分为二, 形成两个子代细胞。 如果通过 G2/M 检测点, 细胞的染色体收缩, 有丝分裂开始。 这两个检查点能够监视细胞周期调控的运作,确保基因和遗传物质准确遗传到子代细胞中。细胞周期调控是在上述检查点控制下,通过各种调控因子的激活和灭活, 使细胞依次启动和完成细胞周期循环的过程。

二.细胞周期过程中, 参与调控的关键分子

保罗·诺斯用遗传学和分子学方法, 识别克隆并描绘了细胞周期的一个关键调节物质 CDK(Cyclin-dependent kinase) 。 他发现 CDK 的功能在进化中被很好的保存了下来, CDK 是通过对其他蛋白质的化学修饰来驱动细胞周期的。 蒂莫西·亨特的贡献是发现了细胞周期蛋白(Cyclin) ——Cyclin 具有调节 CDK 的功能, Cyclin 和 CDK 相互配合能精准地调控细胞周期的全过程。 他发现细胞周期蛋白 Cyclin 在每次细胞分裂中都周期性地降解, 这个机制被证明对控制细胞周期的全过程都非常重要的作用。 这两类重要的蛋白, 再加上细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitor, CKI)。 这三类蛋白共同构成了 Cyclin—CDK—CKI 的信号调控网络,从而实现了细胞周期全过程的精确调控。

1.细胞周期过程的概述

首先, 生长因子与细胞表面的受体结合后, 刺激细胞由 G0 期进入细胞周期过程, 启动细胞内 fos、 jun 和 myc 等 immediate early gene 表达。 在这些 immediate early gene 作用下, 细胞开始激活 CDK 和 G1 期 Cyclin 等分子。 CDK 和 Cyclin 组装成有激酶活性的复合物,Cyclin/CDK 复合物能使 Rb 磷酸化, 使转录因子 E2F 从磷酸化的 Rb 蛋白上脱落下来, 游离的 E2F 可促使与 DNA 合成有关的一系列基因表达, 从而促使 DNA 合成, 推动细胞周期的进展。

pRb-E2F 是细胞 G1 和 S 期转换的一个经典调控途径。 参与细胞周期内源性调控的核心因子是 Cyclin 和 CDK。 其中, Cyclin 对于 CDK 的功能, 起到的是正向促进的作用, 而且 Cyclin 的周期性积累与降解对细胞周期的进程起着关键性的作用。CKI, 这个分子的名字中有一个 inhibitor, 对于 CDK起到负向的抑制作用。 CKI 能和 CDK 或 Cyclin 或 Cyclin-CDK 复合物结合, 抑制 CDK 的催化活性。 Cyclin 和 CKI 分别对 CDK 进行一正一反的调控。一旦这种正负调控的平衡被打破,细胞就可能发生异常增殖。

2.Cyclin 和 CDK 的介绍

在哺乳动物细胞, Cyclin总共有 8 类, 分别是 Cyclin A-H。 其中 Cyclin D 有 D1、 D2 和 D3 三种, Cyclin B 有 B1 和B2 两种。 所以 Cyclin 连同亚类, 总共有 11 种亚类。 Cyclin 含量随细胞周期时相的变化而变化, 不同的 Cyclin 在不同的周期时相内开始表达, 或者是达到含量和活性的峰值。 而 CDK在整个细胞周期中, 表达相对恒定的。 所以在整个细胞周期的调控过程中, 有明显周期性表达的 Cyclin 和表达相对稳定的不同的 CDK 相互结合形成复合物, 从而激活 CDK 的激酶活性, 达到在不同的时相精准调控细胞周期的功能。 因为 Cyclin 要和 CDK 相互结合成复合物之后, 才能发挥调控细胞周期的功能 。

Cyclin 对细胞周期的调控, 主要表现在 G1 期和 S 期/M 期。

(1)G1 期的 Cyclin 及相关 CDK

G1 期 Cyclin 在 G1 期和 G1/S 期交界处发挥重要的作用。 G1/S 期和 G2/M 期恰好是两个非常重要的check-point(检查点) 。 因此, Cyclin 是整个细胞周期过程中最核心的分子。 Cyclin 的表达调控, 不仅保证了细胞周期的精准性, 同时也介导了检查点 check-point 功能。

G1 期 Cyclin 主要包括 Cyclin D1、 D2、 D3、 E 和 C。

Cyclin D1 是发现最早也是研究最深入的 Cyclin。 CyclinD1 在 G1 早期表达, 是细胞周期启动因子, 它也是生长因子感应器。 Cyclin D1 过表达使细胞加速从 G1 到 S 期转换,细胞快速通过 G1/S 检查点, S 期缩短; 阻断或敲除 CyclinD1, 使细胞发生细胞周期阻滞,可以诱导细胞发生凋亡。 Cyclin D 能和 CDK4 或 CDK6 结合, 形成复合物(到底是结合 CDK4还是结合 CDK6, 由细胞种类决定)。 Cylin D 与 CDK4/CDK6 结合后, 能使 CDK4/6 的 172位酪氨酸残基发生磷酸化, 激活 CDK 的激酶活性。

Cyclin E 的合成开始于 G1 中期, 表达水平最高是在细胞进入 S 期, 同时 Cyclin E 的降解也发生在 S 期, 而 Cyclin E 在 G2 和 M 期不表达。 Cyclin E 主要在 G1 晚期发挥作用,是G1 期和 S 期转换的限速因子。 在 G1 期和 S 期, Cyclin E 能和 CDK2 形成复合物, 能使 Rb因磷酸化而失活, 磷酸化的 RB 与 E2F 分离, 失去对 E2F 转录活化功能的抑制, 使细胞从G1 期进入 S 期。

(2)S 期/M 期的 Cyclin 及相关 CDK

S 期的 Cyclin 主要是 CyclinA, M 期 Cyclin 主要有 Cyclin B。 它们分别在 S 期以及 G2 和 M期交界处发挥作用, 诱导细胞分裂。

A) S 期的 Cyclin 主要是 CyclinA, 在 G1 晚期开始增多, 在 S 和 G2 期达到表达峰值, 并能检测出激酶活性。 如果细胞内 CyclinA 表达受到抑制, 细胞周期会停滞在 S 期。 当细胞进入S 期之后, 由于 Cyclin E 的表达水平迅速降低, 从而使 G1 期的 CyclinE-CDK2 复合物解体。游离的 CDK2 又能和 S 期高表达的 Cyclin A 结合, 从而形成 Cyclin A-CDK2 复合物。 另外,也有报道, Cyclin A 也能与 CDK1 结合, 并且在 G2 期达到活性峰值, 随后迅速降解失活。不过, 传统观点还是认为在 S 期, Cyclin A 主要和 CDK2 形成复合物, 介导细胞通过 S 期。

B) M 期 Cyclin 主要有 Cyclin B, CyclinB 在 G1 晚期开始合成, 在 S 期表达升高, 在 G2 晚期和 M 期表达达到峰值, 并进入核内与 CDK1 结合形成复合物, 从而激活 CDK1 的激酶活性。 Cyclin B-CDK1 主要在 G2 末期发挥作用, 可以引导细胞进入有丝分裂的 M 期。 当细胞退出 M 期, Cyclin B 降解, CDK1 的激酶活性失活, 底物去磷酸化, 促进染色体的凝集,核膜核仁重建, 引导细胞进入下一个细胞周期。

不同的 Cyclin 分子在细胞周期的不同时相内的表达情况, 它们所发挥的功能以及能与他们相互结合的 CDK 等信息。

3.CKI 的结构与功能

目前已知的 CKI(Cyclin dependent kinase inhibitor)可划分为两大类: 一类是Ink4(Inhibitor of CDK4), 特异性抑制 CDK4-Cyclin D1 或者 CDK6-Cyclin D1 的磷酸化激酶活性; 另一类是 KIP(kinase inhibition protein), 抑制大多数 CDK-Cyclin 的磷酸化激酶活性。

(1)Ink4 介绍

我们先介绍 Ink4, 现已知的 Ink4 包括 p16(Ink4a/MTS1)、 p15(Ink4b/MTS2)、p18(Ink4c)、p19(Ink4d) 。

这里有两个问题需要大家注意:

问题一: 这些基因都有很多个名称。 例如 P16、 p16INK4a、 MTS1, 指的都是同一个分子。 而且这些分子在文献中都很常见, 很难说哪个名称就比其他名称更普遍更被大家所接受。

问题二: 分子不能弄混淆。 比如我们在 NCBI 上查询 CDKN2A 这基因, 网站上会告诉你,这个基因有很多的其他名称, 例如 P16, p16INK4a, MTS1 等等, 除此之外还有其他的别称,例如 p14, p14ARF 等。 一般的读者看到这里, 都会想当然地认为 p14 和 p16 只是同一个分子的两种名称而已。 这就陷入了一种误区, 其实 p14 和 p16 是两个完全不同的蛋白, 发挥完全不同的功能。 编码 p14 和 p16 蛋白的基因都位于染色体的 9p21 位置, 编码 p14 的基因和编码 p16 的基因有共同的外显子 2 和 3, 但是它们的外显子 1 是不同的。 p14 是外显子 1β; 而p16 是外显子 1α。 由于 p14 和 p16 的外显子 1 不同, 而且发生了读码框的移位, 导致 p14和 p16 的蛋白序列也是不同的, 所以 p14 和 p16 是完全不同的两个蛋白分子, 序列不同, 参与的信号通路也不同。 p16 属于 CKI, 参与 p16-Cyclin D1/CDK4 复合物到 Rb 的信号传递,也就是调控细胞周期的 Rb 途径; 而 p14 参与 p14-MDM2-p53 信号通路的调控, 通过解除MDM2 介导的 p53 信号的抑制, 使得 p53 表达升高, 最终启动细胞周期的阻滞或凋亡。 虽然从最终的效应来看, p14 和 p16 都能导致细胞周期的阻滞, 但是它们所参与介导的信号通路是完全不同的。

Ink4 蛋白的 N 末端含有 4 个钩状重叠组成的二级结构, 和 CyclinD1 的序列有很高的同源性, 因此 Ink4 能和CyclinD1 竞争性结合 CDK4 或者 CDK6, 抑制 CyclinD-CDK4/CDK6 的复合物, 从而抑制了Rb 的磷酸化作用, 使得 E2F 与未磷酸化的 Rb 结合, 阻断了 E2F 依赖的基因转录, 最终实现抑制细胞周期进展的效果。 Ink4 失活将导致细胞周期调控紊乱, 目前已在多种肿瘤如胰腺癌、 非小细胞肺癌、 神经胶质细胞癌、 急性白血病等中发现存在 p16Ink4a 基因缺失的现象。

(2)KIP 的介绍

KIP 全称是 kinase inhibition protein, 激酶抑制蛋白。 现已知的 KIP 包括 p21cip1 (Cyclin inhibition protein 1)、 p27kip1 (kinase inhibition protein 1)及 p57kip2 三种细胞周期抑制蛋白。这三个 KIP 分子在 N 末端有结构及功能的相似性, 都含有一个保守的 80 个氨基酸序列, 能抑制 CDK4-CyclinD1、 CDK6-CyclinD1、 CDK2-CyclinE、 CDK2-CyclinA 的蛋白激酶复合物的活性。 虽然三个 KIP 分子: p21、 p27 和 p57, 在 N 末端有序列上的相似性, 但是它们 C末端区域含有各不相同的功能区。 p27kip1 C 末端有一个苏氨酸的磷酸化位点, 可以抑制 H1组蛋白的磷酸化; p21cip1 C 末端有 40 个氨基酸残基的肽段, 可以和 DNA 聚合酶δ的辅助因子 PCNA发生结合, 从而覆盖了 PCNA 的某些功能区, 使 PCNA 不能与 DNA 聚合酶δ形成复合物, 从而影响 DNA 复制。

(3)小结

总结一下, CKI(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子) 可以分为两大类, 一类是 Ink4, 代表分子 p16、 p15、 p18 和 p19。 Ink4 分子和 Cyclin 有结构上的相似性, 可以通过竞争性结合的方式, 阻断 CyclinD 和 CDK4/CDK6 的复合物, 从而阻断细胞周期; 另一类是 KIP(激酶抑制蛋白) , 代表分子是 p21、 p27 和 p57。 KIP 分子也可以阻断 Cyclin 和 CDK 之间的复合物, 在这一点的功能上, KIP 和 Ink4 类似, 但是 KIP 分子的 C 末端差异很大, 从而介导了不同 KIP 分子发挥不同的特异性功能。

三.细胞周期调控途径及机制

细胞周期的顺利进展需要 Cyclin、CDK、CKI多因素之间相互协同作用。目前研究发现 Cyclin、CDK、 CKI 对细胞周期的作用主要通过两条途径来实现, 一条是 Rb 为主的网络调控途径;另一条是 p53 为主的调控途径。

1.以 Rb 为主的网络调控途径

  1. 生长因子结合相应的受体, 通过信号传递, 促进 Cyclin 基因表达;
  2. Cyclin 与相应 CDK 结合, 形成 Cyclin-CDK 激酶复合物,促进 Rb 蛋白磷酸化;
  3. 非磷酸化的 Rb 原本和转录因子 E2F 相互结合。 在发生磷酸化之后, Rb 释放核转录因子E2F;
  4. 游离的 E2F 进入核内, 结合一系列具特殊序列的基因启动子区, 促进下游基因的表达;
  5. 这些基因的产物促进细胞进入细胞周期的程序。

2. 以 p53 为主的调控机制

哺乳动物细胞在受到 DNA 损伤后, 细胞周期的进程将会停滞于两个关键的检查点, 即 G1/S检查点和 G2/M 检查点。 抑癌基因 p53 主要在 G1 检查点上发挥重要作用。 p53 可作为转录因子, 诱导下游蛋白的产生, 从而达到调控细胞周期的作用。 常见的机制有三种:

  1. p53 可诱导 p21 的表达。 p21 基因启动子区域具有 p53 结合位点。 p53 能与其结合并激活p21 基因转录。 当细胞 DNA 受损后, p21 基因在 p53 诱导下表达水平可升高, 能抑制 CDK活性, 尤其是 CyclinD-CDK4 复合物活性, 阻止细胞从 G1 期进入 S 期, 使细胞停止于 G1期, 从而有更多的时间修复 DNA 模板。 如果 DNA 损伤严重无法修复, 将导致细胞凋亡。
  2. p53 可诱导 GADD45 合成。 GADD45 可以结合 PCNA, 抑制 DNA 合成, 从而抑制细胞进入 S 期。
  3. 诱导 Bax 产生。 Bax 为凋亡相关基因, 与 bcl-2 相同作用, 共同调节细胞凋亡。在 p53 通路中, p53 可诱导产生 p21, 而 p21 本身就是 CKI, 在 Rb 调控机制中有重要作用。因此, Rb 调控通路与 p53 调控通路并不是完全独立分开的, 而是在某些调节子之间存在着相互作用(crosstalk)。

四.细胞周期相关的实验检测

1.检测明星分子

看前面相关分子

2.PI 染色实验

检测细胞周期, 除了上面提到的检测明星分子之外, 更常用的细胞学检测方法是 PI 染色实

验。 简单介绍一下原理: 在细胞周期的整个过程中, G0/G1 期发生于 DNA 复制之前, 因此细胞内染色体表现为两倍体(2N); 而在 S 期, DNA 发生复制, 因此 S 期的细胞染色体介于两倍体和四倍体之间(2N < 染色体< 4N) ; 在 G2/M 期, 由于 DNA 已经复制完成, 因此细胞内染色体数量是四倍体(4N) 。 PI 全称是碘化丙啶。 它是插入性核酸荧光染料, 能选择性地嵌入核酸 DNA 双链螺旋的碱基之间并发出荧光。 PI 结合的量与 DNA 的含量成正比例关系, 用流式细胞仪进行分析就可以得到细胞周期各个阶段的 DNA 分布状态, 从而计算出各个细胞周期时相的百分含量。

本文分享自微信公众号 - MedBioInfoCloud(MedBioInfoCloud),作者:DoubleHelix

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原始发表时间:2019-06-23

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