基因芯片数据挖掘分析表达差异基因

基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

目前已有许多数据库，包括NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，ArrayExpress数据库(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)，和TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)等等，记录和储存着大量芯片相关的数据，其中GEO数据库是目前最大最全的数据库，可供科研人员查询和下载相关数据。

下面和大家分享一下基因芯片数据的预处理方法。

1）分析前需要对数据进行背景信号处理：背景处理即过滤芯片杂交信号中属于非特异性的背景噪音部分。一般以图像处理软件对芯片划格后，每个杂交点周围区域各像素吸光度的平均值作为背景，但此法存在芯片不同区域背景扣减不均匀的缺点。也可利用芯片最低信号强度的点（代表非特异性的样本与探针结合值）或综合整个芯片非杂交点背景所得的平均吸光值做为背景。

其中，各字母的意义如下： N：条件数； G：基因数目（一般情况下，G>>N）；行向量mi=(mi1,mi2,…,miN)表示基因i在N个条件下的表达水平（这里指绝对表达水平，亦即荧光强度值）； 列向量mj=(m1j,m2j,…,mGj)表示在第j个条件下各基因的表达水平（即一张芯片的数据）； 元素mij表示第基因i在第j个条件下（绝对）基因表达数据。m可以是R（红色，Cy5，代表样品组）。也可以是G（绿色，Cy3,代表对照组）。

2）芯片数据清理：经过背景校正后的芯片数据中可能会产生负值，还有一些单个异常大（或小）的峰（谷）信号（随机噪声）。对于负值和噪声信号，通常的处理方法就是将其去除，常见数据经验型舍弃方法有：A.标准值或奇异值舍弃法；B.变异系数法；前景值＜200；前景值-平均数/前景值-中位数＜80%等等。然而，数据的缺失对后续的统计分析（尤其是层式聚类和主成分分析）有致命的影响。Affymetrix公司的芯片分析系统会直接将负值修正为一个固定值。

缺失值得处理方法：对数据的删除，通常是删去所在的列向量或行向量。一个比较常用的做法是，事先定义个阈值M。若行（列）向量中的缺失数据量达到阈值M，则删去该向量。若未达到M，有两种方法处理，一是以0或者用基因表达谱中的平均值或中值代替，另一个是分析基因表达谱的模式，从中得到相邻数据点之间的关系，据此利用相邻数据点估算得到缺失值（类似于插值）。填补缺失值（k临近法）：利用与待补缺基因距离最近的k个临近基因的表达值来预测待填补基因的表达值。

3）提取芯片数据的表达值：由于芯片数据的小样本和大变量的特点，导致数据分布呈偏态、标准差大。对数转换能使上调、下调的基因连续分布在0的周围，更加符合正态分布，同时对数转换使荧光信号强度的标准差减少，利于进一步的数据分析。

4）芯片数据的归一化：经过背景处理和数据清洗处理后的修正值反映了基因表达的水平。然而在芯片试验中，各个芯片的绝对光密度值是不一样的，在比较各个试验结果之前必需将其归一化（normalization，也称作标准化）。数据的归一化目的是调整由于基因芯片技术引起的误差，不是调整生物RNA 样本的差异。在同一块芯片上杂交的、由不同荧光分子标记的两个样品间的数据，也需归一化。常用的方法是平均数、中位数标准化(mean or median normalization)：将各组实验的数据的log ratio中位数或平均数调整在同一水平。中位数标准化：将每个芯片上的数值减去各自芯片上log Ratio值的中位数，使得所有芯片的log Ratio值中位数就变成了0，从而不同芯片间log Raito具有可比性。

5) 差异基因表达分析: 经过预处理，探针水平数据转变为基因表达数据。为了便于应用一些统计和数学术语，基因表达数据仍采用矩阵形式。

A.芯片数据的差异分析主要包括三种方法：

1. 倍数分析方法：倍数变换fold change，单纯的case与control组表达值相比较，对没有重复实验样本的芯片数据，或者双通道数据采用这种方法。

2. 参数法分析（t检验）：当t超过根据可信度选择的标准时, 比较的两样本被认为存在着差异。但小样本基因芯片实验会导致不可信的变异估计，此时采用调节性T检验。

3. 非参数分析：由于微阵列数据存在“噪声”干扰而且不满足正态分布假设，用t检验有风险。非参数检验并不要求数据满足特殊分布的假设，所以可使用非参数方法对变量进行筛选。如经验贝叶斯法、芯片显著性分析SAM法。

B. 芯片数据的差异分析的常用软件包括：

1. Limma：它是一个功能比较全的包，既含有cDNA芯片的RAW data输入、前处理（归一化）功能，同时也有差异化基因分析的“线性”算法（limma: Linear Models for Microarray Data），特别是对于“多因素实验（multifactor designed experiment）”。limma包的可扩展性非常强，单通道（one channel）或者双通道（tow channel）数据都可以分析差异基因，甚至也包括了定量PCR和RNA-seq。

2. DESeq2和EdgeR包: 都可用于做基因差异表达分析，主要也是用于RNA-Seq数据，同样也可以处理类似的ChIP-Seq,shRNA以及质谱数据。这两个都属于R包，其相同点在于都是对count data数据进行处理，都是基于负二项分布模型。

3. GFOLD软件：对于有生物学重复的数据（一般的转录组数据都会有生物学重复），我们一般采用一个叫edgeR和DEseq的R包。但如果预先测了一批数据没有重复的数据进行一个预分析。这时候edgeR依然可以用，不过需要认为指定一个dispersion值，这样的不同的人就可以有不同的结果，在查阅了很多资料之后呢，大家一致认为没有重复的转录组数据应该用GFOLD软件。 后续会出详细的分析教程，并提供R代码