PCR中的引物设计

一.找目的基因的CDS序列保守区域

通过Nucleotide数据库查询目的基因

进入NCBI的Nucleotide数据库：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/

在搜索框直接键入要搜索的基因，这里以人的mTOR基因为例，检索结果如下：

Nucleotide数据库的搜索结果还是比较智能的，搜索结果前面推荐的就是我们的要的，我们做基因检测，做的PCR是定量PCR，设计引物是以基因的转录本为模板设计的，所以我们点击RefSeq transcripts。

随便点击其中一个

该页面的信息想了解的可参考文章：生物信息学初识篇——第一章：生物数据库，这里我们只需要往下拉，找到CDS。

点击CDS，页面会跳到序列位置，并将CDS区背景高亮。

将序列以fasta格式粘贴到一个Word文档中

同样的方法将其他转录本的CDS序列也复制粘贴进来。这里需要注意的是，8个转录本中，有7个是软件预测的，只有第一个是被验证过的。设计引物时可以只用已经验证的这一个，如果其他基因，有多个已经验证转录本，就抛弃那些软件预测的序列，只要验证的序列。这里的mTOR只有一个被验证，理论上可以只有这一条序列设计引物，这里为了演示，我也下载了其他预测的序列进行了序列比对。

将所有序列都以fasta格式粘贴到同一个word文档中后，利用Word的查找替换功能将所有数字删掉。

然后利用MEGA 7 软件进行序列比对，找到7个转录本的保守区域，关于MEGA 7 软件使用教程和序列比对，可参考：生物信息学初识篇——第三章：分子进化与系统发生，该文章介绍了MEGA 7建系统发育树的过程，案例是做蛋白，只需要将蛋白序列换成DNA序列即可。序列比对部分是一样的，只是不需要用来建系统发育树，或者自己百度一下MEGA 7做序列比对，教程应该很多，其实做序列比对的工具很多，之前的文章也有介绍，可以参考本公众号的文章：生物信息学初识篇——第二章的内容。

我们通过比对后获得mTOR的保守区域序列：

ATGAACCATGTCCTAAGCTGTGTCAAGAAGGAGAAGGAACGTACAGCGGCCTTCCAAGCCCTGGGGCTACTTTCTGTGGCTGTGAGGTCTGAGTTTAAGGTCTATTTGCCTCGCGTGCTGGACATCATCCGAGCGGCCCTGCCCCCAAAGGACTTCGCCCATAAGAGGCAGAAGGCAATGCAGGTGGATGCCACAGTCTTCACTTGCATCAGCATGCTGGCTCGAGCAATGGGGCCAGGCATCCAGCAGGATATCAAGGAGCTGCTGGAGCCCATGCTGGCAGTGGGACTAAGCCCTGCCCTCACTGCAGTGCTCTACGACCTGAGCCGTCAGATTCCACAGCTAAAGAAGGACATTCAAGATGGGCTACTGAAAATGCTGTCCCTGGTCCTTATGCACAAACCCCTTCGCCACCCAGGCATGCCCAAGGGCCTGGCCCATCAGCTGGCCTCTCCTGGCCTCACGACCCTCCCTGAGGCCAGCGATGTGGGCAGCATCACTCTTGCCCTCCGAACGCTTGGCAGCTTTGAATTTGAAGGCCACTCTCTGACCCAATTTGTTCGCCACTGTGCGGATCATTTCCTGAACAGTGAGCACAAGGAGATCCGCATGGAGGCTGCCCGCACCTGCTCCCGCCTGCTCACACCCTCCATCCACCTCATCAGTGGCCATGCTCATGTGGTTAGCCAGACCGCAGTGCAAGTGGTGGCAGATGTGCTTAGCAAACTGCTCGTAGTTGGGATAACAGATCCTGACCCTGACATTCGCTACTGTGTCTTGGCGTCCCTGGACGAGCGCTTTGATGCACACCTGGCCCAGGCGGAGAACTTGCAGGCCTTGTTTGTGGCTCTGAATGACCAGGTGTTTGAGATCCGGGAGCTGGCCATCTGCACTGTGGGCCGACTCAGTAGCATGAACCCTGCCTTTGTCATGCCTTTCCTGCGCAAGATGCTCATCCAGATTTTGACAGAGTTGGAGCACAGTGGGATTGGAAGAATCAAAGAGCAGAGTGCCCGCATGCTGGGGCACCTGGTCTCCAATGCCCCCCGACTCATCCGCCCCTACATGGAGCCTATTCTGAAGGCATTAATTTTGAAACTGAAAGATCCAGACCCTGATCCAAACCCAGGTGTGATCAATAATGTCCTGGCAACAATAGGAGAATTGGCACAGGTTAGTGGCCTGGAAATGAGGAAATGGGTTGATGAACTTTTTATTATCATCATGGACATGCTCCAGGATTCCTCTTTGTTGGCCAAAAGGCAGGTGGCTCTGTGGACCCTGGGACAGTTGGTGGCCAGCACTGGCTATGTAGTAGAGCCCTACAGGAAGTACCCTACTTTGCTTGAGGTGCTACTGAATTTTCTGAAGACTGAGCAGAACCAGGGTACACGCAGAGAGGCCATCCGTGTGTTAGGGCTTTTAGGGGCTTTGGATCCTTACAAGCACAAAGTGAACATTGGCATGATAGACCAGTCCCGGGATGCCTCTGCTGTCAGCCTGTCAGAATCCAAGTCAAGTCAGGATTCCTCTGACTATAGCACTAGTGAAATGCTGGTCAACATGGGAAACTTGCCTCTGGATGAGTTCTACCCAGCTGTGTCCATGGTGGCCCTGATGCGGATCTTCCGAGACCAGTCACTCTCTCATCATCACACCATGGTTGTCCAGGCCATCACCTTCATCTTCAAGTCCCTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTCCTGCCCCAGGTCATGCCCACGTTCCTTAACGTCATTCGAGTCTGTGATGGGGCCATCCGGGAATTTTTGTTCCAGCAGCTGGGAATGTTGGTGTCCTTTGTGAAGAGCCACATCAGACCTTATATGGATGAAATAGTCACCCTCATGAGAGAATTCTGGGTCATGAACACCTCAATTCAGAGCACGATCATTCTTCTCATTGAGCAAATTGTGGTAGCTCTTGGGGGTGAATTTAAGCTCTACCTGCCCCAGCTGATCCCACACATGCTGCGTGTCTTCATGCATGACAACAGCCCAGGCCGCATTGTCTCTATCAAGTTACTGGCTGCAATCCAGCTGTTTGGCGCCAACCTGGATGACTACCTGCATTTACTGCTGCCTCCTATTGTTAAGTTGTTTGATGCCCCTGAAGCTCCACTGCCATCTCGAAAGGCAGCGCTAGAGACTGTGGACCGCCTGACGGAGTCCCTGGATTTCACTGACTATGCCTCCCGGATCATTCACCCTATTGTTCGAACACTGGACCAGAGCCCAGAACTGCGCTCCACAGCCATGGACACGCTGTCTTCACTTGTTTTTCAGCTGGGGAAGAAGTACCAAATTTTCATTCCAATGGTGAATAAAGTTCTGGTGCGACACCGAATCAATCATCAGCGCTATGATGTGCTCATCTGCAGAATTGTCAAGGGATACACACTTGCTGATGAAGAGGAGGATCCTTTGATTTACCAGCATCGGATGCTTAGGAGTGGCCAAGGGGATGCATTGGCTAGTGGACCAGTGGAAACAGGACCCATGAAGAAACTGCACGTCAGCACCATCAACCTCCAAAAGGCCTGGGGCGCTGCCAGGAGGGTCTCCAAAGATGACTGGCTGGAATGGCTGAGACGGCTGAGCCTGGAGCTGCTGAAGGACTCATCATCGCCCTCCCTGCGCTCCTGCTGGGCCCTGGCACAGGCCTACAACCCGATGGCCAGGGATCTCTTCAATGCTGCATTTGTGTCCTGCTGGTCTGAACTGAATGAAGATCAACAGGATGAGCTCATCAGAAGCATCGAGTTGGCCCTCACCTCACAAGACATCGCTGAAGTCACACAGACCCTCTTAAACTTGGCTGAATTCATGGAACACAGTGACAAGGGCCCCCTGCCACTGAGAGATGACAATGGCATTGTTCTGCTGGGTGAGAGAGCTGCCAAGTGCCGAGCATATGCCAAAGCACTACACTACAAAGAACTGGAGTTCCAGAAAGGCCCCACCCCTGCCATTCTAGAATCTCTCATCAG

二.设计引物

引物选择的一般原则：

避免多个重复碱基出现，避免4个或超过4个G出现在引物序列中；按照PCR引物要求设置参数，如产物长度，荧光定量PCR产物不应该超过400bp，最好80-150bp， 普通的PCR产物长度在300-400bp左右为宜；GC％为30％-70%，最好45%－55%；引物长度为18-25bp，最好22-24bp；Tm值在58-60℃，最好60℃；3’端至少4个碱基保守，最好为T， C， G；

荧光定量PCR的引物尽量选择G、C结尾的引物。

设计引物的工具很多，这里以Primer Premier 6.0为例。

Primer Premier 6.0安装包：

链接：https://pan.baidu.com/s/11vack5Z0x5nUeWQkYjWdNg 提取码：ac27

打开软件Primer Premier 6.0，点击左上角的New sequence，复制找到的保守区序列，到图中位置，点击Add。

点primer search，设置引物参数

点击Search，下面显示所有结果中最优的一对引物，从各种参数来看，这对引物质量不错。

更多的引物参数还需要点击All Structures进行查看，比如是否形成发夹结构，可以看到这对引物不会形成发夹结构。

所以我们就获得了人mTOR基因的mRNA定量PCR的引物：

上游引物F:CCTCCATCCACCTCATCA

下游引物R:GACGCCAAGACACAGTAG

CTACTGTGTCTTGGCGTC

三.引物验证

NCBI BLAST网址http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，点击Nucleotide

BLAST

在打开的界面中Enter Query Sequence下面框中，按照5’－3’顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔20个以上n。

Program Selection选择Somewhat similar sequences(blastn) ，点击BLAST

可以看到搜索结果排在前面的就是我们的mTOR，我们就可以找公司合成，然后进行实验，在实验中进一步验证，如果引物的扩增曲线具有单一的峰，说明引物设计没有问题。

四.其他引物设计工具

1. Thermo Fisher的Multiple Primer Analyzer

https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

注意：如上图的格式输入上下游引物序列，还要确定引物的工作浓度、反应体系的盐浓度、评价的灵敏性。结果如下图。得到预查询引物的TM值， GC含量以及是否形成引物二聚体。

2.Primer3web在线引物设计

http://primer3.ut.ee/

3.Universal Probe Library在线引物设计

https://lifescience.roche.com/en_cn/brands/universal-probelibrary.html#assay-design-center

4.最后给两个小工具，评价单条引物

不过要注意这里给出的TM值为跑PCR 时推荐设定的退火温度。

http://www.ab126.com/Chemistry/3160.html

http://ggene.cn/html/protocol/bioinformatics/2015/0415/6838.html