MTT法测细胞增殖和药物毒性实验protocol

1.原理

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（即OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

2.试剂及耗材

CO2细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 、低速离心机、酶标仪、8道排枪、培养基 、胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板等。

3.注意事项

（01）选择适当的细胞接种浓度和培养时间。

（02）设置调零孔（只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul）。

（03）设置空白孔（细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜）。

（04）MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。

（05）96孔板边缘32孔用无菌PBS填充，因为边缘的32孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大。同时加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中间孔的水分。

（06）防止药物与MTT反应。如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是不需要的。

（07）吸收值分析。在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。

（08）培养过程中换液。100ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持50h以上，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果。如果培养时间长，在48h应该换液一次。

（09）避免血清干扰。高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

（10）判断污染。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大。在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。

（11）加DMSO前要把液体小心吸掉。但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法，悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板，清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。对于贴壁细胞，可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸。

（12）MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，0.22μm过滤后4℃避光保存两周内，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解，当MTT变为灰绿色时不能再用。一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。

4.实验步骤：

4.1 细胞标准曲线制作

（1） 0.5%的胰酶消化对数期细胞，待细胞即将脱离皿底时，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10×10^4/ml。

（2）取4块96孔板，分别标记为0h、24h、48h、72h，，每组设置3个复孔，每孔加入100 μL细胞悬液，每板分别铺8组细胞，分别为3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。

（3）5%CO2，37℃培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测：

a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h；

b) 小心吸去孔内培养液（用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液）；

c) 每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10～20 min，这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解（尤其在冬天））；

d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长μl570nm的吸光值；

（4） 标准曲线制作

以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。选择合适的细胞浓度进行实验。

4.2 MTT药物毒性实验步骤

（1）0.5%的胰酶消化对数期细胞，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10×104/ml，药物毒性实验一般每孔细胞数量5000—10000个（具体数目根据预实验判断）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。下面是几种常见的细胞接种数量(来源于网络，仅供参考）。

（2）将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入90μl细胞悬液, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加5个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

（3）5%CO2，37℃培养箱继续培养，待细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物。（原则上，细胞贴壁后即可加药，或两h，或半天时间，但我们实验室常在前一天下午铺板，次日上午加药。加药时按照所需的浓度在EP管中先稀释好，每孔加入10μl已经稀释好药物，使每孔最终体积为100μl，为了避免产生误差，稀释好的药物体积应略大于所需药物的体积。需要注意的是，以DMSO 作为溶剂溶解的药物至少需要进行100倍以上稀释才能使用，因为作用于细胞DMSO的含量高于1%时，DMSO会杀死细胞从而影响判断。）

（4）按照药物作用时间点，每24 h取出一块96孔板检测：

a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h；

b) 小心吸去孔内培养液（用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液）；

c) 每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10～20 min，这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解（尤其在冬天））；

d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长490nm的吸光值(有用570nm的）；

（5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

（6）MTT结果分析

关于如何计算IC50，使用改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下：

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：

代入计算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

该药物的IC50值为45.186ug/ml，IC50值也可以通过Graphpad prism7进行计算，具体可参考文章：

https://jingyan.baidu.com/article/fd8044fa19f4065030137a60.html；

https://www.graphpad.com/guides/prism/7/curve-fitting/index.htm?reg_dr_inhibit_variable.htm

4.3 MTT增殖实验

（1）分别收集各组对数期的细胞，调整细胞悬液浓度；

（2）取4块96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，铺板使待测细胞为5×10^3 cell/孔（边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应），每组设置3个复孔；

（3）5%CO2，37℃培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测：

a) 每孔加入20 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4h；

b) 小心吸去孔内培养液（用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液）；

c) 每孔加入150μL DMSO，使结晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10～20 min，这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解（尤其在冬天））；

d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长490nm的吸光值(有用570nm的）。

（4）数据处理及MTT增殖曲线绘制。