细胞侵袭实验

对于进行细胞侵袭的研究者来说,传统试验方法具有染色及计数会占用实验者大量的精力,且数据单一,实验通量及重复性低等特点。本实验采用罗氏全新的方法来监测细胞侵袭,将 CIM-Plate 16 结合 RTCA DP Analyzer使用,这个独特的装置可在无标记条件下对细胞侵袭进行实时监控。CIM-Plate 16 由上室和下室组成,两者之间由微孔膜分隔开。金制串珠状微电极紧密结合,附着于 PET 膜下层,并覆盖 80%表面积。趋化剂添加到下室,上室内添加研究的细胞和选择性添加细胞外基质胶。当细胞设法穿过膜, 进入下室,黏附到电极上,系统可测量电阻抗变化。随着微孔膜下侧细胞数目的增多,电阻抗增大,表现为细胞指数的变化,并被 RTCA DP Analyzer 记录下来。接下来,我们介绍整个细胞侵袭实验的流程。

一、编辑实验程序

打开 RTCA software, 可看到三个用户权限 ID,本次实验我们用 administrator 登录,密码为小写的 administrator。user one 和 user two 登录时无需密码。点击确认后,可根据实验需求进行选择适当的 cradle。

启动 RTCA DP 软件后,如果软件仍停留在上一个实验界面,可以在 file 中点击 release,开启一个新的实验。experiment note 页面下,填写本次实验的相关信息,包括实验名称,所使用细胞板的 ID number 信息等,备注栏内填写一些简单的实验设计。到 Layout 页面下,输入本次实验的设置,选中 A1-H1,填写细胞系名称,细胞类型是 HT-1080,每孔 20000 个细胞,点击 apply,设置信息完成。选择 A1-F1,本实验将从高到低浓度 Matrigel 进行包被,最高浓度为 10%,以 2 倍稀释度稀释,两个重复。选择 G1 和 H1,填写 serum Free Medium 作为空白对照,保存后,将 A1-H1信息复制到第二排。此时可见 16 孔板设置完成的实验信息。转到 schedule 页面,点击增加一步按钮。第一步是用于检测背景值的实验步骤, step-status显示为 IDLE,表示未完成,请勿更改背景检测步骤参数。点击增加步骤按钮,建立第二个实验步骤,这里根据检测时间的长短,可以自行设计实验的检测次数及间隔时间。

二、准备实验以及包被

从冰箱中取出 Assembling tool 以及 CIM plate 上板。拆开上板,可见板上和盖子上均有蓝点标记,将蓝点对蓝点,把板放在 Assembling tool 上。由于 CIM plate 板的电极是铺在孔膜的背部,所以上板不能直接接触桌面,安装时需特别注意。首先进行 Matrigel 包被,每孔内加入 50 µl matrigel ,每做完一个梯度,即 4 个孔后,马上从孔内轻轻吸出 30µl Matrigel。如果出现气泡,用枪头小心剔除。空白对照的四个孔同样加入 50µl 的无血清培养基,然后吸出 30µl。盖上盖子,将整个 Assambling tool 连同板子 ,放入培养箱中孵育 4-5 小时,使 Matrigel凝结。

三、组装 RTCA CIM Plate-16 以及测量 CI 背景值

取出 CIM plate 下板,蓝点对蓝点方向,放在 Assambling tool 第二个槽内,下板中加入160µl 预温好的完全培养基,动作缓慢且在最后轻抬枪头,可见整个液面形成漂亮的弧形。将 CIM-Plate 16 Assembly Tool 旋转 90 度,小心不要干扰液面将上板拿起,水平移到下板上方,快速用力扣下,中间不能有停顿,听到卡卡两声,表明上板和下板安装完成。检查安装是否紧扣在一起。在上板中每孔加入 30 µl 无血清培养基, 盖上上板盖子将整块 CIM-Plate 16 放入 RTCA DP 分析仪。放在培养箱中平衡一个小时。一小时后, 进入 schedule 页面,选中第一步,点击开始按钮。背景值测完后,显示 ready for starting next step.回到 Message 页面,看是否有任何报错信息。

四、准备细胞,并加入 RTCA CIM Plate-16 上腔

取出 CIM plate, 重新放回到超净台中的 Assambling tool 上,每孔加入 100 微升含 20000个细胞的细胞悬液。细胞准备参照本光盘的细胞传代及其他视频的相关操作,重悬 HT-1080细胞。为了避免培养箱内由于温差产生蒸腾作用而引起边缘效应,将 CIM 培养板,在常温下静置半个小时。

五、运行实验

将 CIM plate 重新放回 RTCA DP 分析仪上,看到提示 plate scanned, connection is OK 后,点击开始第二步。这时机器开始每 15 分钟检测一次孔内细胞的迁移的情况。

六、实验结果分析

在 Cell Plot 页面,选择显示平均值以及标准差, 点击 add ,可见不同组得到的实验信号。如图所示,当 Matrigel 浓度最大时,细胞侵袭越困难,而无血清培养基对照孔内,细胞侵袭的信号就非常明显。根据包被 Matrigel 的浓度由高到低,细胞侵袭能力逐渐增强。

七、注意事项

1、 CIM-Plate 16 不能重复使用:

CIM-Plate 板上可能会有细胞或包被试剂的残留,影响再次实验的结果可靠性及重复性。

2、健康的细胞培养物:

健康的细胞侵袭效率较高,此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。实验细胞必须在前一天进行细胞传代,并保证消化时细胞融合达 60%-80%

3、 Matrigel 使用要求:

由于 Matrigel 非常容易在常温下凝结成胶状而无法使用,要将 Matrigel 置于冰上。侵袭实验前一天,需要将所需的 Matrigel 从-80 度取出,放在 4 度保存,使其溶解成液状,另外,所有需要接触 Matrigel 的耗材,包括枪头,移液管, CIM plate 上板等需预先放在冰箱-20或者 4 度预冷。

4、无血清培养基制备细胞悬液:

制备细胞悬液前可先让细胞去血清饥饿 12-24h,进一步去除上板中血清的影响,若上层中含血清,下层培养液的趋化作用就会减弱甚至消失了,影响实验的进行。

本文分享自微信公众号 - MedBioInfoCloud(MedBioInfoCloud),作者:DoubleHelix

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原始发表时间:2019-09-14

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