免疫组织化学实验

下面是2个视频的中的操作步骤，关于免疫组化，我们之前也发过文章：免疫组化实验，可以进行参考。

实验前准备

在实验开始前， 要先确保该实验所用到的试剂都准备到位，如：不同浓度梯度的乙醇， PBS 缓冲液， 3%过氧化氢， 10%正常山羊血清， 0.01M 枸橼酸缓冲液，DAB 显色液，二甲苯和抗体等。

本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得提供的移液器， 赛默飞的 QSP盒装吸头、恒温箱，医用微波炉，盖玻片，镊子，洗瓶，湿盒，切片架等。本视频按照以下步骤展开实验：脱蜡复水后进行抗原修复，接着免疫反应，化学染色，最后脱水封片并进行结果分析。

脱蜡复水

首先对组织切片进行脱蜡复水处理：切片在室温放置 60min 后， 浸泡在二甲苯中。10min 后，放入另一个装有二甲苯的染缸再泡 10min。脱蜡后，将组织切片逐级放入无水乙醇、 95%、 85%， 75%， 50%的乙醇中，每次处理均为 5min。水合处理后，将组织切片放入纯水中，孵育 5min， 再转移放入 PBS 缓冲液中孵育 5min。

抗原修复

抗原表位修复之前，需进行内源性过氧化物酶的淬灭处理：滴加 3%过氧化氢溶液于切片上，湿盒孵育 10min。用 PBS 浸泡清洗 3 次，每次 5min，尽可能洗去残留的过氧化氢。将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液中，微波中大火力加热至沸腾并保持 8min，取出容器，待缓冲液温度自然降到室温。反复 2 次， 用PBS 再洗 5min。

免疫反应

用滤纸擦去周围多余的 PBS，滴加 PBS 稀释好的 10%正常山羊血清，室温湿盒封闭 30-60min。孵育结束后， 去除封闭液，滴加一抗工作液， 4°C 孵育过夜。第二天，移去一抗后，用 PBS 洗两次，每次 10min.擦去切片周围多余的液体，滴加二抗工作液，室温孵育 30min。弃去二抗后， PBS 洗两次，每次 10min。

化学染色

去除切片上多余的 PBS,滴加新鲜配制的 DAB 工作液，湿盒孵育，在显微镜下监测染色程度。染色结束后， PBS 浸泡洗去 DAB 染液，每次 5min，重复 3 次。去除残留液体，苏木素复染 2-5min，复染结束后，用水洗去多余染液，在 1%盐酸酒精中分化数秒。再次进行水洗切片。

脱水封片

此过程刚好和复水相反，首先进行 50%乙醇处理 5min，然后依次浸泡在 75%，85%， 95%和无水乙醇中，时间 5min，最后置于二甲苯中进行透明化处理两次，每次均为 10min。脱水处理后，擦去切片周围的液体，滴上 1 滴中性树胶，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。

结果观察

在显微镜下观察实验结果，并于相同的条件下拍取照片进行后续的结果分析。如图所示，苏木素复染细胞核后，细胞核被染上蓝色，实验组胞浆剪呈现棕黄色，阳性信号较强；阴性对照组胞浆不被 DAB 染色。

半定量分析

使用 Image Pro Plus 图像分析软件分析累积光密度值。打开 Image-Pro Plus软件，点击 File，打开实验组和对照组的结果图片。点击 Measure。Calibration，点击 Intensity 进行光密度校对。在 Intensity Calibration 窗口中，点击 New，选中 Std.Optical Density，点击 Optical，点击 Image，选择图中最亮的一点。在 Incident Level 中输入与其最接近的整十数，点击 ok。校正光密度后，点击 Measure，Count/ Size。在 Count Size窗口，点击 Measure，Select Measure，选择测量对象。选中 Area（面积）和 IOD（累积光密度），点击 OK。回到 Count /Size 窗口，点击 Select Color。在 Segmentation 窗口，选择 Histogram Based， HIS 通道。调节饱和度等参数后，点击 Close。选中一张图片，在 Count Size 窗口，点击 View，在 Statistics 窗口可见结果。获得累积光密度值后， 可选用相关软件进行统计学分析。

疑问解答

Doctor A，最近做免疫组化的结果非特异性染色都很深，该怎么解决呢？

Miss Q，非特异性染色是在做免疫组化中经常遇到的问题， 最重要一点，我们可以通过调节一二抗的浓度和孵育时间来控制。至于抗体，建议用单克隆抗体，可减少非特异性染色。通过延长封闭时间、适当增加封闭液浓度也能降低非特异性组分与抗体的结合。DAB 的显色要在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应，避免染色时间过长或 DAB 浓度过高。此外，很多同学在标本染色过程中经常干片，这容易增强非特异性着色。

谢谢 Doctor A，那免疫组化染色呈阴性结果，这又是怎么一回事呢？

遇到这种情况，一般可以从这几点查找原因：

抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；组织切片本身这种抗原含量低；血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短；细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。开始做免疫组化实验时，建议同学们一定要先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

在孵育抗体前，为什么要进行抗原修复呢？

刚才也有提到过，抗原修复是为了使抗原抗体更好地结合。石蜡切片由于处理过程中会造成抗原交联而影响染色结果， 通常需要进行抗原修复以增强显色。多数抗原可以通过抗原修复试剂预处理， 改变醛基固定造成的蛋白交联， 以暴露隐藏的抗原位点。抗原修复对于石蜡切片免疫组化、免疫细胞化学的最终显色结果有着重要的影响。感谢 Doctor A 的悉心讲解，这堂课又学到了好多知识。