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免疫组织化学实验

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DoubleHelix
发布2019-09-17 16:54:47
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发布2019-09-17 16:54:47
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文章被收录于专栏:生物信息云
免疫组织化学又称免疫细胞化学,是通过共价键将酶连接在抗体上,制成酶,标抗体,再利用酶对底物的特异催化作用,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位 。目前通常选用免疫酶组化间接染色法进行实验,利用该技术,可进行细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点,且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起,这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中,免疫组化技术的作用和意义更为重要。

下面是2个视频的中的操作步骤,关于免疫组化,我们之前也发过文章:免疫组化实验,可以进行参考。

实验前准备

在实验开始前, 要先确保该实验所用到的试剂都准备到位,如:不同浓度梯度的乙醇, PBS 缓冲液, 3%过氧化氢, 10%正常山羊血清, 0.01M 枸橼酸缓冲液,DAB 显色液,二甲苯和抗体等。

本实验所使用到的仪器和耗材有:芬兰百得提供的移液器, 赛默飞的 QSP盒装吸头、恒温箱,医用微波炉,盖玻片,镊子,洗瓶,湿盒,切片架等。本视频按照以下步骤展开实验:脱蜡复水后进行抗原修复,接着免疫反应,化学染色,最后脱水封片并进行结果分析。

脱蜡复水

首先对组织切片进行脱蜡复水处理:切片在室温放置 60min 后, 浸泡在二甲苯中。10min 后,放入另一个装有二甲苯的染缸再泡 10min。脱蜡后,将组织切片逐级放入无水乙醇、 95%、 85%, 75%, 50%的乙醇中,每次处理均为 5min。水合处理后,将组织切片放入纯水中,孵育 5min, 再转移放入 PBS 缓冲液中孵育 5min。

抗原修复

抗原表位修复之前,需进行内源性过氧化物酶的淬灭处理:滴加 3%过氧化氢溶液于切片上,湿盒孵育 10min。用 PBS 浸泡清洗 3 次,每次 5min,尽可能洗去残留的过氧化氢。将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液中,微波中大火力加热至沸腾并保持 8min,取出容器,待缓冲液温度自然降到室温。反复 2 次, 用PBS 再洗 5min。

免疫反应

用滤纸擦去周围多余的 PBS,滴加 PBS 稀释好的 10%正常山羊血清,室温湿盒封闭 30-60min。孵育结束后, 去除封闭液,滴加一抗工作液, 4°C 孵育过夜。第二天,移去一抗后,用 PBS 洗两次,每次 10min.擦去切片周围多余的液体,滴加二抗工作液,室温孵育 30min。弃去二抗后, PBS 洗两次,每次 10min。

化学染色

去除切片上多余的 PBS,滴加新鲜配制的 DAB 工作液,湿盒孵育,在显微镜下监测染色程度。染色结束后, PBS 浸泡洗去 DAB 染液,每次 5min,重复 3 次。去除残留液体,苏木素复染 2-5min,复染结束后,用水洗去多余染液,在 1%盐酸酒精中分化数秒。再次进行水洗切片。

脱水封片

此过程刚好和复水相反,首先进行 50%乙醇处理 5min,然后依次浸泡在 75%,85%, 95%和无水乙醇中,时间 5min,最后置于二甲苯中进行透明化处理两次,每次均为 10min。脱水处理后,擦去切片周围的液体,滴上 1 滴中性树胶,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。

结果观察

在显微镜下观察实验结果,并于相同的条件下拍取照片进行后续的结果分析。如图所示,苏木素复染细胞核后,细胞核被染上蓝色,实验组胞浆剪呈现棕黄色,阳性信号较强;阴性对照组胞浆不被 DAB 染色。

半定量分析

使用 Image Pro Plus 图像分析软件分析累积光密度值。打开 Image-Pro Plus软件,点击 File,打开实验组和对照组的结果图片。点击 Measure。Calibration,点击 Intensity 进行光密度校对。在 Intensity Calibration 窗口中,点击 New,选中 Std.Optical Density,点击 Optical,点击 Image,选择图中最亮的一点。在 Incident Level 中输入与其最接近的整十数,点击 ok。校正光密度后,点击 Measure,Count/ Size。在 Count Size窗口,点击 Measure,Select Measure,选择测量对象。选中 Area(面积)和 IOD(累积光密度),点击 OK。回到 Count /Size 窗口,点击 Select Color。在 Segmentation 窗口,选择 Histogram Based, HIS 通道。调节饱和度等参数后,点击 Close。选中一张图片,在 Count Size 窗口,点击 View,在 Statistics 窗口可见结果。获得累积光密度值后, 可选用相关软件进行统计学分析。

疑问解答

Doctor A,最近做免疫组化的结果非特异性染色都很深,该怎么解决呢?

Miss Q,非特异性染色是在做免疫组化中经常遇到的问题, 最重要一点,我们可以通过调节一二抗的浓度和孵育时间来控制。至于抗体,建议用单克隆抗体,可减少非特异性染色。通过延长封闭时间、适当增加封闭液浓度也能降低非特异性组分与抗体的结合。DAB 的显色要在显微镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应,避免染色时间过长或 DAB 浓度过高。此外,很多同学在标本染色过程中经常干片,这容易增强非特异性着色。

谢谢 Doctor A,那免疫组化染色呈阴性结果,这又是怎么一回事呢?

遇到这种情况,一般可以从这几点查找原因:

抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误;抗原修复不全,对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位,以利于与抗体结合;组织切片本身这种抗原含量低;血清封闭时间过长;DAB 孵育时间过短;细胞通透不全,抗体未能充分进入胞内参与反应。开始做免疫组化实验时,建议同学们一定要先做个阳性对照片,排除抗体等外的方法问题。

在孵育抗体前,为什么要进行抗原修复呢?

刚才也有提到过,抗原修复是为了使抗原抗体更好地结合。石蜡切片由于处理过程中会造成抗原交联而影响染色结果, 通常需要进行抗原修复以增强显色。多数抗原可以通过抗原修复试剂预处理, 改变醛基固定造成的蛋白交联, 以暴露隐藏的抗原位点。抗原修复对于石蜡切片免疫组化、免疫细胞化学的最终显色结果有着重要的影响。感谢 Doctor A 的悉心讲解,这堂课又学到了好多知识。

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原始发表:2019-09-15,如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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