单细胞高分文献精读系列（1）--近两年文献纵横

回顾近两年的生物技术热点，单细胞分析技术无疑是各个研究领域大佬们力捧的宠儿。从去年到现在，影响因子20分以上、以单细胞分析为主体的文章已发表近100篇（文末识别二维码，加客服微信，回复“单细胞”获取文献总结清单）。

以单细胞转录组分析为代表，结合后续兴起的单细胞基因组、蛋白组和表观组学，及CRISPR/Cas9细胞标记和组织原位探针技术，生物学的精细调控研究从器官、组织和细胞群体水平直接跃迁到单个细胞的层级。

图一 多维度单细胞分析技术

从近两年文献分析来看，单细胞技术目前的主流应用领域包括：肿瘤、免疫、干细胞、大脑图谱和组织发育等。同时，得益于单细胞分析获得的巨大数据量，生物信息学也异军突起。（学生物信息，锁定科研猫！）

单细胞分析占据了《Nature Methods》每期至少一篇的版面，并穿插于每一项单细胞分析相关研究中。而这正说明了单细胞分析技术目前尚处于数据和方法原始累积的阶段。相比于其他实验方法在特定领域研究的特异性，现阶段单细胞的研究思路，不管是在上述的哪一研究领域（肿瘤、免疫、干细胞、大脑图谱和组织发育等），都表现出空前的一致性及大文章少见的套路性。

以单细胞测序分析在肿瘤免疫中的研究为例，近两年CNS系列文章即有10篇，其中6篇出自Cell主刊，从文章标题中Landscape、profile、cell map、define cell types等关键词就可以看出，就是告诉大家本文章只是利用了最新的技术，对收集到的样本进行了描述性研究而已。

内心的OS大致就是这样：在此过程中，我也没揭示啥厉害的机制，但基于我牛叉的病人样本和舍得砸钱的大规模单细胞测序，我把肿瘤中的免疫细胞都归了类。但鉴于细胞种类太多，我也不可能每一种都做功能验证，因此我就挑了一种，单独拎出来做了这群细胞的临床相关性研究，发现果然相关~ 由此得出结论我通过单细胞分析，发现了一群与肿瘤预后/放化免疫疗法反应性/治疗抵抗等等相关的免疫细胞。这么听起来是不是很easy呢~

当然，上述只是戏谑的说法，这些研究从样本收集（样本的多样性和样本信息完备性）到实验组和对照组的配备，再到分析策略，都堪称神作！只是任何新兴领域原始资本的积累都是这么简单粗暴，由此也可预测单细胞技术发展后期将是生信玩家的天下。

（看不清没关系，联系客服要清单~）

图二 单细胞分析在肿瘤免疫中的应用文献

从实际操作来看，目前单细胞相关研究自样本选择开始论高低。肿瘤病人样本是基本要求，当然也有小鼠来源（但一旦样本非人源，后续机制研究工作量将大幅提升），另一取巧方式也可以将单细胞技术与最近大火的类器官培养技术联合（但类器官也是病人来源啊…哈哈哈~）

病人样本的基础上，样本信息收集也是丧心病狂。肿瘤、癌旁正常组织、外周血都收齐是基本操作，更厉害的当属联合临床放化疗和免疫治疗，治疗前后/有效/无效/抵抗/多药抵抗各组齐全，甚至还能提供病人生存周期、用药信息、肿瘤进展等各种能想到的借用数据时可能需要的资料。

样本收集后，单细胞获取方法那简直是八仙过海各显神通，科研人员脑洞之大和动手能力之强让人无法想象！在微流控、流式分选、微孔捕获、毛细管吸、口吸管、显微镜下挑取、油滴包被等各路神仙中，目前以10x Genomics为代表的油滴捕获技术因其快速、操作简便、超高通量等优势成为多数研究者的首选。当然，随着单细胞基因组、蛋白组、表观遗传组等技术的发展，细胞获取后不仅仅要保护其胞内RNA，对其他组分如DNA、蛋白质等均有较高的保存要求，也就需要结合多个技术优势，才能实现单细胞多维度覆盖分析。

单细胞组分测序后，目前对原始数据的质控和标准化依然存在很大的争议，从Nature Methods最近还在发怎么去除单细胞分析批次效应（batch effects）的文章便可见一斑。但不论选择哪种方法，最终只要与生物学意义相符即可被认可。目前几乎所有单细胞文章，质控之后第一件事情，就是分群，分群自然是根据基因或蛋白或其他任何参数的表达差异，而这些具有差异的参数一定代表了某一生物学特性，及与之相对应的生物学功能。

根据细胞亚群差异，利用生信手段预测细胞发育的先后顺序（拟时分析），再结合前述功能分析，即可确定某一群细胞的生物学定位，及细胞群体之间的相关性。如果在收集样本时，已经通过barcode标记等方法获取了每个细胞的组织定位信息，同时协同质谱流式、表观遗传等多层次分析，将打开认识单个细胞生物学特性和细胞之间相互调控及转化新世界的大门。

细胞学水平的研究终究要回归机体功能，不管是发现了新的细胞群体还是对已发现的细胞有了新的功能注解，最终要么在动物模型上完成功能验证和机制研究，要么实现临床转化，作为疾病预后、治疗反应的预测指标或成为新的治疗靶点。

图三 单细胞分析在肿瘤免疫中的应用思路

作为一出场让生物医学各个领域研究者们都跃跃欲试的技术，单细胞分析的应用当然远不止上述的研究套路，所谓大道从简，神仙们在看起来相似的套路下也能玩出花来，接下来几周时间内，我将详细介绍单细胞技术在免疫、肿瘤和干细胞研究中的神文，敬请期待。

参考文献详见pubmed-single cell rna seq-IF19表格。

本文原创作者：LepR

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