NC |SCALE准确鉴定单细胞ATAC-seq数据中染色质开放特征

作者：洲更 （上海生科院）博客：http://xuzhougeng.top/archives/Analysis-sc-ATAC-seq-with-SCALE文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-12630-7

SCALE全称是Single-Cell ATAC-seq analysis vie Latent feature Extraction, 从名字中就能知道这个软件是通过隐特征提取的方式分析单细胞ATAC-seq数据。

在文章中，作者从开发者的角度列出了目前的scATAC-seq分析软件，chromVAR, scABC, cisTopic, scVI，发现每个软件都有一定的不足之处，而从我们软件使用者的角度，其实可以考虑都试试这些工具。

SCALE结合了深度生成模型(Depp Generative Models)变分自动编码器框架(Variational Autoencoder, VAE)与概率高斯混合模型(Gaussian Mixture Model, GMM)去学习隐特征，用于准确地鉴定scATAC-seq数据中的特征。

文章通过一张图来解释了软件的工作机制：

SCALE框架

SCALE将sc-ATAC-seq的输入数据x(Cells-by-Peaks矩阵)建模成一个联合分布，

p(x,z,c)，c是GMM组件中对应的预定义的K个聚类，z是一个隐变量，是细胞在所有peak中实际可能的值，用于后续的聚类和可视化。z通过

z=μz+σZ×ϵz=μz+σZ×ϵ 计算而得，公式里面的 μzμz σzσz 是编码器网络从x中学习而得，ϵϵ 则是从 $\mathbb(0,\mathbf)$ 抽样而成。

从公式中我们还可以发现z其实和GMM的c有关，所以p(x,z,c)也可以写成P(x|z)p(z|c)p(c)，而p(c)是K个预定义聚类分布的离散概率分布，p(z|c)服从混合高斯分布，而p(x|z)则是服从多变量伯努利分布(multivartiable Bernoulli distribution), 通过解码者网络建模而成。

当然从一个软件使用者的角度而言，我们不会去关心代码，也不会关心原理，我们更关心的是这个工具能做什么。SCALE能做以下的分析

• SCALE可以对隐特征聚类识别细胞类群
• SCALE可以降噪，恢复缺失的peak
• SCALE能够区分批次效应和生物学细胞类群之间的差异

软件安装

推荐使用conda的方式进行软件安装（我测试过了，运行没有问题）

第一步：创建一个环境，名字就是SCALE，并且启动该环境

conda create -n SCALE python=3.6 pytorch
conda activate SCALE

第二步：从GitHub上克隆该项目

git clone git://github.com/jsxlei/SCALE.git

第三步：安装SCALE

cd SCALE
python setup.py install

之后分析的时候，只需要通过conda activate SCALE就能启动分析环境。

考虑后续要交互的读取数据和可视化，那么建议再安装一个Jupyter

conda install jupyter

软件使用

SCALE支持两类输入文件：

• count矩阵，行为peak，列为barcode
• 10X输出文件: count.mtx.gz, peak.tsv, barcode.tsv

我们以官方提供的Forebrain数据集为例进行介绍，因为这个数据相对于另外一个数据集Mouse Atlas小多了。

我们在服务器上新建一个文件夹，用于存放从https://cloud.tsinghua.edu.cn/d/bda0332212154163a647/下载的数据

mkdir -p Forebrain

保证Forebrain有下载好的数据

$ ls Forebrain
data.txt

之后运行程序

SCALE.py -d Forebrain/data.txt -k 8 --impute

软件运行步骤为：

• 加载数据: Loading data
• 模型训练: Training Model
• 输出结果: Saving imputed data

其中模型训练这一步时间比较久，可以尝试用GPU加速（我是普通CPU服务器没有办法）。最终会在当前文件夹看到一个output文件夹，里面有如下内容:

• imputed_data.txt: 每个细胞在每个特征的推断值，建议用--binary保存二进制格式
• model.pt: 用于重复结果的模型文件，--pretrain参数能够读取该模型
• feature.txt: 每个细胞的隐特征，用于聚类和可视化
• cluster_assignments.txt: 两列，barcode和所属类群
• tsne.txt, tsne.pdf: tSNE的坐标和PDF文件，坐标文件可以导入到R语言进行可视化

上面是命令行部分，下面则是Python环境进行交互式操作，输入jupyter notebook，之后在网页上打开

首先是导入各种Python库

import pandas as pd
import numpy as np
from sklearn.metrics import confusion_matrix
from matplotlib import pyplot as plt
import seaborn as sns
from scale.plot import plot_embedding, plot_heatmap

然后加载分析结果，包括聚类信息和特征信息

y = pd.read_csv('output/cluster_assignments.txt', sep='\t', index_col=0, header=None)[1].values
feature = pd.read_csv('output/feature.txt', sep='\t', index_col=0, header=None)

通过热图展示不同聚类细胞之间的差异图

plot_heatmap(feature.T, y, 
             figsize=(8, 3), cmap='RdBu_r', vmax=8, vmin=-8, center=0,
             ylabel='Feature dimension', yticklabels=np.arange(10)+1, 
             cax_title='Feature value', legend_font=6, ncol=1,
             bbox_to_anchor=(1.1, 1.1), position=(0.92, 0.15, .08, .04))

heatmap

如果要矫正批次效应，可以通过根据feature的heatmap，去掉和batch相关的feature来实现

我们可以展示SCALE对原始数据纠正后的值(imputed data), 该结果也能提高chromVAR鉴定motif的效果

imputed = pd.read_csv('output/imputed_data.txt', sep='\t', index_col=0)

展示聚类特异性的peak， 分析由mat_specificity_score和cluster_specific完成

from scale.specifity import cluster_specific, mat_specificity_score

score_mat = mat_specificity_score(imputed, y)
peak_index, peak_labels = cluster_specific(score_mat, np.unique(y), top=200)

plot_heatmap(imputed.iloc[peak_index], y=y, row_labels=peak_labels, ncol=3, cmap='Reds', 
             vmax=1, row_cluster=False, legend_font=6, cax_title='Peak Value',
             figsize=(8, 10), bbox_to_anchor=(0.4, 1.2), position=(0.8, 0.76, 0.1, 0.015))

聚类特异性peak

参数介绍

通过SCALE.py -h可以输出SCALE的所有可用参数

• -d/--dataset: 单个文件矩阵应该指定文件路径，10X输出的多个文件则是文件目录
• -k: 设定输出结果的聚类数
• -o: 输出文件路径
• --pretrain: 读取之前训练的模型
• --lr: 修改起始学习速率, 默认是0.002，和模型训练有关
• --batch_size: 批处理大小， 默认就行，不需要修改（和批次效应处理无关）
• -g GPU: 选择GPU设备数目，非GPU服务器用不到
• --seed: 初始随机数种子，通常在遇到nan缺失时考虑修改
• -encode_dim, -decode_dim: 编码器和解码器的维度，通常也不需要修改
• -latent 隐藏层维度
• --low, --high: 过滤低质量的peak, 即出现比例高于或者低于某个阈值的peak，默认是0.01和0.9。作者推荐保留1万-3万的peak用于SCALE分析。如果数据质量很高，且peak数不多于10万，那么可以不过滤。
• --min_peaks: 过滤低质量细胞，如果该细胞的peak低于阈值
• log_transform: log2(x+1)的变换
• --max_iter: 最大迭代数，默认是30000, 可以观察损失收敛的情况来修改，也就是训练模型这一步输出的信息
• -weight_decay: 没有说明
• --impute: 保存推断数据，默认开启
• --binary: 推荐加上该参数，减少imputed data占用空间
• --no_tsne: 不需要保存t-SNE结果
• --reference: 参考细胞类型
• -t: 如果输出矩阵是列为peak，行为barcode，用该参数进行转置

对于使用者而言，我们一般只用修改-k更改最后的聚类数，--low, --high, ---min_peaks来对原始数据进行过滤，以及加上--binary节约空间。

假如在训练模型阶段，发现输出信息为loss=nan recon_loss=nan kl_loss=nan,十有八九最终会报错退出， 可以如下的参数调整

• 更改--seed
• 用更加严格的条件过滤peak，例如-x 0.04 或 -x 0.06
• 降低初始的学习速率，--lr 0.0002

ChIP-seq基本分析流程适用于ATAC-seq的前期分析。