mRNA的胞内研究技术路线

眼看2019年就快过完了，老板交给你的标书完成了吗？实验方案搞定了吗？

RNA也分为很多种了，像miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA等，前面也有蛮多的文章介绍过了，咱们今天主要介绍mRNA的研究路线。

mRNA的研究也分细胞外和细胞内，细胞外的研究技术很多，咱们今天了解一下mRNA的细胞内研究技术和策略：转录、成熟、出核、翻译、降解。

mRNA的一生其实很短暂，从基因转录开始，到RNA前体分子加工成熟，出核到胞质中，在核糖体中翻译成蛋白，然后被RNase降解，完成了使命。

（1）硬技术介绍

1. 细胞固定后mRNA胞内显影

技术：smFISH、branched DNA FISH、Sequential hybridization smFISH

单分子荧光原位杂交（smFISH）

普通FISH只能定性，而定量版本就是smFISH，它是一种新的RNA定量分析方法，能报告转录本丰度和空间定位，。

Branched DNA FISH

这个技术就是设计一些一级DNA探针的二级探针，加强荧光信号

MERFISH

MERFISH是一个高度多重化的smFISH成像方法，可以在单个细胞中鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位。该技术使用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，可谓高逼格的FISH技术。

2. 活细胞RNA胞内显影

活细胞中RNA要实时观测，这里面也需要进行荧光显色，和“固定”状态的细胞内RNA观测不同，活细胞状态下不能影响RNA的翻译，所以探针需要针对非翻译区。

Molecular beacons

这种设计是很聪明的，首先合成互补的DNA探针，然后一端加载荧光基团，另外一端加载淬灭剂，而DNA探针末端有2、4个碱基互补，这样在天然状态下，该探针是没有荧光的，只有探针和RNA结合后，才会发光显影。

Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling

这两种技术都采用发光基团（荧光素）和探针分开的策略，先让探针渗透到细胞中结合，然后加荧光素进去结合，最后发光的条件性发光的策略，一般设计探针时放在非翻译区。