你的pcr为什么定量不出来？

最近有很多同学私聊小编说，刚进入实验室开始科研，但qPCR结果却总是不理想，实验一直停滞不前，非常的苦恼。记得我刚进实验室的时候，为了验证目标lncRNA在癌和癌旁的组织中有没有差异，闷着头做了两个月的qPCR。那么什么是qPCR呢，为什么有的同学结果总是不理想呢？今天小编就带大家一起探讨一下~

（图片来自我p的）

qPCR就是荧光定量PCR，就是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化，实时检测每次循环产物量的变化，对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。如果标本中的量多，循环数就少。

qPCR的应用（两个字：广泛！）

绝对定量：病原体检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测...

相对定量：基因的表达差异，耐药研究...

qPCR实验方法的选择

大家在查阅别人的实验文章时应该不难发现，目前实验室里常用的几种方法有SYBR Green I法、水解探针法（TaqMan法）等等。这些方法都有不同的优缺点，比如TaqMan法虽然重复性高，但是它的成本也比较高。童鞋们可以根据自己的实验室条件和预算进行选择。我简单介绍一下比较常用又平民的方法------SYBR GreenI法吧。

SYBR Green I是一种结合在dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。图上这抹神秘的绿色就是它啦~（原理和具体的实验步骤相信大家肯定比我还熟悉，就不在这里赘述啦，挑重点的叨叨一下）

（图片来自网络）

SYBR Green法的优缺点

Advantages

成本低

使用方便

兼容溶解曲线

Disadvantages

不能做多重检测

无模板特异性

灵敏度低

SYBR GreenI法的作用原理

（图片来自网络）

SYBR Green I法进行检出的时候，要根据熔解曲线来确认PCR产物的特异性。

（图片来自网络）

有个私信我的同学问，为什么自己明明是按照步骤来的，上机以后却总显示未检出呢，我觉得可能跟童鞋们的实验习惯有关系。

一些要注意的习惯问题：

·RNA提取时，所有用具应该去RNsae处理；

·离心的时候应该4℃预冷；

·RNA提取结束后短期可存于-20℃冰箱，长期置于-80℃，避免反复冻融

·提取的RNA要有较高的完整性和纯度，OD 260/280一般在2.0左右，小于2.0时可能是杂质太多，大于2.0的时候则可能是RNA发生了降解；

·在设置程序时，要仔细核对目标温度、恒温时间和循环次数等参数；

·使用SYBR Green I时应避光。

（图片来自我p的）

好的，大家改掉自己上面的小习惯以后发现，欸？我的实验结果怎么害是透着一丝不对劲呢？小编以前在做的时候，也经常出现各种不正经的结果，有的结果甚至师兄师姐也没遇见过，当时因为不知道问题出在哪，头秃的不行。为了童鞋们不走我以前的弯弯路，我从网上收集了一下资料，给大家稍微总结总结~

小宝贝们可能出现的问题： ·没有CT值出现 模板降解：应避免反复冻融 引物或者探针降解：可以通过PAGE电泳检测一下完整性

·CT值出现晚 PCR引物过长：产物长度一般选择80-150bp PCR各反应成分的降解或加样量不足

·溶解曲线不齐，多个主峰 引物浓度不适当：应注意上下游引物的浓度配比 引物设计问题：应避免引物二聚体和发夹结构出现

·重复样本差异大 加样不准确 模板浓度低

·溶解曲线只有上升支 扩增产物的Tm值较高，可在设置溶解曲线时将95度改为99度

最后还是本人的碎碎念~

qPCR是比较基础的实验，应用是非常广泛的。整个实验过程其实并不难，关键在于是否了解它的原理，是否正确的做好每一步。当然啦，真的遇见问题的时候，我们也不要气馁，要积极的思考问题出在哪里，并在接下来的实验中改正。如果遇到什么不懂的或者有什么想法，欢迎在下方滴滴我哦。希望大家一切顺利，多发paper！