Nature | 心脏发生的单细胞分析揭示了器官水平发育缺陷的基础

生信宝典

发布于 2019-11-27 10:56:44

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发布于 2019-11-27 10:56:44

1. CPC:cardiac progenitor cells，心脏祖细胞
2. FHF和SHF:the first heart fields/the second heart fields，第一和第二心脏区域
3. OFT:outflow tract，流出道
4. RV/LV：right ventricle/left ventricle，右心室/左心室
5. SV：sinus venosus，静脉窦
6. AVC：atrial and atrioventricular canal，房室管
7. AHF：anterior heart field，前心区域
8. pSHF：后部的SHF

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研究背景

心脏从两个中胚层衍生的心脏祖细胞（CPC），第一和第二心脏区域（分别为FHF和SHF）和多能神经嵴细胞发展而来。器官发生往往涉及多种类型细胞的整合;细胞类型特异性基因网络的失调则会导致出生缺陷，如先天性心脏缺陷是最常见的畸形，并且是由心脏祖细胞的亚群的破坏引起，但导致器官水平缺陷的个体祖细胞的转录变化仍然未知。

在这里，作者使用single-cell RNA sequencing来探究早期心脏祖细胞，在正常和异常心脏发生过程中发挥的作用，揭示了特定细胞亚群的失调如何造成灾难性后果。作者利用单细胞RNA测序分析的基于网络的计算方法预测谱系指定转录因子，将Hand2鉴定为流出道细胞但不是右心室细胞的特异性决定因子，尽管Hand2-null小鼠中右心室形成失败。Hand2-null胚胎的时间单细胞转录组分析揭示了流出道心肌特异性的失败，而右心室心肌发生特异性转变但未能正确分化和迁移。Hand2的丧失还导致视黄酸信号传导失调和心脏祖细胞的前 - 后模式的破坏。

这项工作揭示了指定个体心脏祖细胞中命运和分化的转录决定因子，并暴露了单细胞分辨率下破坏心脏发育的机制，为研究先天性心脏缺陷提供了框架。（注意：在发育过程中，许多因子的表达的特异性波动性较大，因此时间点的选择往往是研究胚胎器官发育的重头戏）

研究方案

Sample: 在三个发育阶段从小鼠胚胎的心源区收集超过36,000个体细胞；（ day (E)7.75 ，E8.25，E9.25 ）

36,777 cells captured from wild-type and 37,149 cells captured from Hand2-null embryos in total

单细胞建库流程：典型10X Genomics；

10X单细胞测序分析软件:Cell ranger，从拆库到定量

测序数据分析介绍

工具: Chromium Single Cell 3′ Library and Gel Bead Kit v.2 (PN-120237) and Chromium i7 Multiplex Kit (PN-120262) ；

比对:Mouse genome,version mm10；

过滤：Seurat v.2.2 R package (http://satijalab.org/seurat/) ，过滤掉大于8,000和少于1,500个基因的细胞来实现的；（注意：作者只过滤了gene,并没有过滤细胞，可能是怕过滤掉一些罕见少有的细胞）

Seurat亮点之细胞周期评分和回归

降维与聚类：表达矩阵→归一化→PCA分析，挑选高变化表达的基因，进行细胞分型；

Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（十一）- Scater单细胞表达谱PCA可视化

伪时序分析：Monocle 2 package (http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/)

结果分析

图1（a-c）

作者首先通过对在三个发育阶段从小鼠胚胎的心源区收集的36,000个体细胞进行测序来鉴定心脏细胞特异性和形态发生的转录特征：（1）CPC在胚胎期开始分化晚期心脏新月体（E7.75）; （2）当FHF形成线性心管时，SHF在E8.25处迁移到管的前极和后极; （3）心脏导管循环并包含SHF衍生的流出道（OFT），右心室（RV），静脉窦（SV）和心房细胞与FHF衍生的左心室（LV），心房和房室管（AVC）细胞在E9.25（图1a-1c）。

图1(d-e)

细胞进行分类后主要划分为7种细胞类型，分别为多能Isl1+组细胞、内皮或心内膜细胞、心外膜细胞、心肌细胞、神经嵴来源的间质细胞、近轴中胚层和外侧板中胚层细胞。作者随后对多种类型的细胞进一步进行亚分型，比如内皮或心内膜谱系的三个亚群：血管内皮祖细胞，特定的内皮细胞或心内膜细胞，以及启动内皮 - 间充质转化程序的心内膜细胞，这是瓣膜发育的典型特征（图1d-1e）。

尽管左心室（LV）和右心室（RV）具有相似的功能，但它们来自不同的祖细胞，并且每个群体中独特富集的基因失调均会导致腔室特异性先天性畸形。其中某些基因仅在一个室中富集，与心室的不同起源和生理学一致。值得注意的是，作为钙处理的关键调节剂的受磷蛋白（Pln）和肠激素胆囊收缩素（Cck）主要在RV细胞中表达，作者用原位杂交证实了这一点。（注意：比起我们一般都会用小提琴图来对某gene的转录水平程度进行表示，作者用小鼠模型进行证明更为有效）

附图

其中，有一类细胞心肌细胞并不能通过高变基因将其归入任何一个亚群。其大部分为E7.75细胞并表达多种亚型的基因。作者使用伪时间来验证这个群体代表早期心肌祖细胞（EMP）的混合群体的假设（附图a-e)。(注意：我们在一般情况下用特异性marker定义污染时，常会使用两种不同转化的细胞类型的特异性marker在一种细胞中共表达时可能存在污染，但在发育情况下也可能是祖细胞)

图2（a-b）

在E7.75和E8.25处捕获的AHF和pSHF群体分成9个亚群（图2a，b）。A-C起源于pSHF，而E-I起源于AHF。亚群A和I来自E7.75，并且每个群体中的大多数细胞共表达基因Nodal，Lefty2和Pitx2，表明AHF和pSHF的左右不对称细胞的转录组之间的差异。群体D富集FHF，LV和肌节基因的表达，具有最小的Isl1表达，是早期FHF祖细胞的特征，而群体F似乎代表最早的OFT细胞（图2b）。

图2（c-e）

伪时分析表明pSHF clusterA和B，AHF clusterE和F以及AHF clusterH和I表示三个分化细胞群的连续阶段（图2c-e）。相比之下，pSHF clusterC包含分化为心肌的连续细胞（图2b，d）

图3（a-c）

控制心脏祖细胞进入不同亚系的分子调控因子在很大程度上是未知的。因此，作者应用了一种叫“Boolean network-based lineage-specifier prediction method”应用于E7.75和E8.25捕获的AHF，RV和OFT细胞。将Irx4和Plagl1鉴定为RV心肌细胞的特异性调控因子，将Hand2，Tead2和Arid3b鉴定为OFT心肌细胞特异性调控因子。Hand2表达在OFT心肌中富集; 虽然预测Hand2是OFT的谱系调控因子，不是RV心肌的，但其缺失会导致严重的RV发育不全。在SHF中特异性缺失Hand2时，重现了这种表型，强调了它在这个祖细胞中的需要，尽管其机制尚不清楚。于是，作者分析了在E7.75和E8.25探究了普通和Hand2-null心脏祖细胞的单细胞转录组（图3a-c）。

图3（d-h）

Hand2-null胚胎中的AHF，OFT和RV前体早在E7.75转录失调。例如，我们鉴定为AHF和OFT标记的Rgs5基因在E7.75的Hand2-null AHF和OFT细胞中被下调（图3d,h）,编码染色质重构体Smyd1的基因也在E8.25的Hand2-null AHF细胞中下调。

作者想要探究在Hand2缺陷型小鼠中SHF细胞的极化分化发育是否受到影响。Crabp1和Crabp2对视黄酸信号有相反的调控作用，参与到SHF祖细胞在心脏后方的谱系决定。Crabp1通常在AHF中高表达，沉默视黄酸信号加快分解代谢；Crabp2促进视黄酸的核转运和转录激活，在AHF中低表达。Hand2缺陷AHF细胞中，Crabp1被下调，而Crabp2被上调，这就导致视黄酸信号的异位激活和AHF的后置化定位（图3d-g）。

AHF及其衍生物在Hand2缺陷型小鼠中显示出更广泛的失调。例如 Sema3c，在后期的E8.5-E9.0 OFT心肌中表达以吸引PlxnA2阳性神经嵴细胞，在E7.75的Hand2-null OFT和RV祖细胞以及E8.25的AHF中异位表达（图3e，f）。OFT标记基因Tdgf1在E7.75的Hand2-null OFT细胞中下调，在E8.25几乎不存在（图3f，j）。相比之下，野生型和Hand2-null RV细胞在E7.75具有相等的Irx4表达水平，表明Hand2的丧失不能阻止获得心室特征（图3e）。然而，在E8.25的Hand2-null RV细胞中向成熟心肌分化的标志物被下调，表明这些细胞实际上在产生特异性后被失调。

图4

作者此时进行了伪时序分析发现，E8.25的AHF、OFT、RV细胞的分化轨道由AHF开始（图4a-c），分成三个细胞状态：一种OFT状态、两种不同的RV状态。Hand2缺陷型细胞严重缺失OFT状态；RV状态1由数量相当的WT和Hand2缺陷型细胞组成；RV状态2主要是WT细胞。这些数据表明Hand2缺陷型OFT命运的细胞特化过程被打断，RV命运的细胞正常特化，但分化有缺陷，和之前的谱系决定分析结果一致。最后，研究人员用原位杂交的方法证明Irx4+Cck+RV细胞在E8.5定位到LV后面的AHF区域，在E9.25定位到OFT区域，出现错误迁移现象。

生理意义

精确的解析人体正常生理器官的发育和由于缺失所导致的发育功能的紊乱，这对确定发育机制有重大意义，也是确定出生缺陷和潜在产后干预的预防方法的先决条件；

单细胞文章点评

该篇文章其实抓到了一个在心脏发育中比较关键的转录因子Hand2，并且感觉仅仅是利用单细胞测序对该因子进行分析；

文章用到了一个比较新的算法，就是“Boolean network-based lineage-specifier prediction method”，用于推测在发育过程中的特异性决定因子；

我们并不知道作者是如何锚定到这个因子的，最起码通过单细胞测序个人认为是无法锚定的，所以作者可能已经通过湿实验已经发现了该因子在心脏发育过程中的作用，然后再应用单细胞进行分析；

参考文献

T. Yvanka de Soysa et al. Single-cell analysis of cardiogenesis reveals basis for organ-level developmental defects Nature

单细胞

转录组研究

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原始发表：2019-11-23，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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