单细胞转录组揭示视网膜细胞异质性

A single-cell transcriptome atlas of the adult human retina

遗传性视网膜疾病正成为成人失明的主要原因，当前已鉴定到与视网膜疾病相关的200多个基因，涉及特定的视网膜细胞类型。

先前对于成人和胎儿的视网膜遗传表达谱已有研究，但是关于视网膜细胞异质性的研究较少，对高度分化的视网膜细胞的转录通路依然不清楚。

因此，了解人类单个视网膜细胞类型的转录组情况对于解析视网膜中的细胞多样性以及研究导致单个视网膜细胞类型疾病的视网膜基因非常重要。

本研究通过对三个健康捐赠者视网膜scRNA-seq数据进行分析，为人类视网膜细胞类型的转录组表达谱提供了新的见解，并为人类神经视网膜建立了高细胞分辨率的参考对象。

材料：

• 1、三个捐赠者的视网膜scRNA-seq数据
• 2、胚胎视网膜数据（scRNA-seq）和hiPSC-derived cone photoreceptors(bulk-RNA seq) 前期捕获到23000个细胞，经质控和过滤得到20009个细胞。

数据分析：

CellRanger 2.1.0版本 参考基因组：GRch38 Seurat V2.2.1

Identification of major cell types in the human retina using scRNA-seq

• 图A.B：三个捐赠者的视网膜单细胞转录组测序数据，使用seurat经过滤筛选，获得20009个细胞，降维聚类形成18个cluster，B展示的是三个样本cluster分布。
• 图c-d:基于已知的makers,18个cluster中的16个进行分类，其中c5和c14表达的maker基因来自多个细胞类型，没有进行定义。从分类看出，视杆细胞有6个cluster，双极细胞有3个cluster。(每个圆圈的大小表示在集群中表达makergene的细胞的百分比)
• 图e:鉴定到的18个cluster进行相关性分析，相同的细胞类型高度相似，除此之外，视杆细胞和视锥细胞以及胶质细胞和其他视网膜神经元有高度相关性。（上面的三角形表示相关的z值，下面的三角形表示聚类中基因表达的相关系数）
• 图f:对每个cluster进行差异基因表达分析。（选择差异基因上调表达的前10个基因进行展示）

总而言之，我们在提供的数据集中对人视网膜中所有主要细胞类型的转录组进行了分析。由于它们的丰度，在随后的分析中，我们重点研究了感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）和神经胶质细胞。

Profiling healthy and degenerating human rod photoreceptor subpopulations

分析健康和退化人的视杆细胞亚群

• 图a:分析14759个视杆细胞，形成6个cluster，选取已知的7个maker基因在16个cluster中热图展示，1,6,7表达量在视杆细胞很高，4在视杆细胞和视锥细胞都表达。（棕色表示大于等于100的转录数量）
• 图b：六个视杆细胞亚群三个样本的细胞所占比列。发现许多视杆细胞cluster主要来自单个样本。C3来自三个捐赠者。（这可能是由于系统的偏见，如组织检索时间的差异，捐赠者的年龄，或其他样本制备的变异）
• 图c:为了定义和分类视杆细胞的异质性，使用了MALAT1（长的非编码RNA，在视网膜稳定和疾病其重要作用）基因鉴定。约66%的细胞表达高，其余的细胞表达量低。

利用MALAT1表达作为鉴定基因，研究了高表达（MALAT1-hi；每细胞> 4.68标准化转录本）或低表达（MALAT1-lo；每细胞<4.68标准化转录本）的视杆细胞之间的差异。

通过MALAT1表达的差异能够区分视杆细胞的异质性 图d:利用MALAT1表达分析三个样本（五个文库）中MALAT1-hi和MALAT1-lo的细胞比列，三个样本中高表达分别占66%，90%，36%。

图e:为了近一步证实，进行的原位杂交。outer nuclear layer （外核层）(ONL). INL, inner nuclear layer（内核层）; OPL, outer plexiform layer（外网状层）

为了排除有样本变异造成的MALAT1视杆细胞亚群的存在，使用典型性相关分析进行矫正（其用来矫正视杆细胞样本特异性变异）。

对于CCA，我们使用了所有五个样品共有的可变性最高的基因，并使用前两个CC尺寸（通过双权中间相关（bicor）分析选择）对重组数据进行了比对。使用头20个对齐的CC尺寸以0.6的分辨率在Seurat中重新排列对齐的细胞

• 图a,b：校正后，视杆细胞亚群形成3个cluster，最终图中展示了13个cluster。b是三个捐赠者视网膜样本的展示。
• 图c：对7个视杆细胞的maker基因进行热图展示，
• 图d,e：对基因MALAT1在视杆细胞的三个cluster的表达丰度的展示，cca0表达丰度低，在cca1和cca10表达丰度高，结果与原位杂交结果一致。上述结果也表明了MALAT1异质性并不是由个体之间的差异造成的。
• 图f:为了检验数据中是否还有低质量细胞，t-sne图展示8个核糖体蛋白基因，没有上调表达。
• 图g:然而，在clustercca10中有1.4%的细胞表达线粒体基因相关的蛋白，可能该cluster含有低质量的细胞。
• 图4：随后对不同时间点的视网膜细胞进行原位杂交，结合上面的结果表明MALAT1可以作为判断视杆细胞处于退化还是健康的状态。

Transcriptome profile of cone subtypes in the human retina

随后对视锥细胞进行分析

• 图a:选取11个maker gene进行分析，通过视锥细胞marker基因的表达，在转录组数据中鉴定到564个视锥细胞。视锥细胞可以根据表达的视蛋白划分为三种亚型（s.m.l）,但是m和l蛋白98%是相似的。
• 图b,c:展示3种视锥细胞亚型在c10cluster中细胞比列。
• 图d:进一步研究视锥细胞亚群的分子鉴定maker基因及表达丰度，通过筛选的差异基因对视锥细胞进行亚群区分。结合前人研究结果和本文数据显示TBX2 marks 是 S-cones 中特异表达,很保守。

Assessment of glial cells in human retina

视网膜神经胶质细胞评估

主要研究两类视神经胶质细胞型：Mu¨ller glia c9, 和 retinal astrocytes c16（视网膜星型胶质细胞）

• 图e：展示了9个在神经胶质细胞中常用的maker基因。结果显示，这9个基因在两类细胞中的表达水平是不同的。VIM, GLUL, and S100A1两类细胞高表达；GFAP represents a reliable marker for retinal astrocytes。

通过这些差异基因的表达丰度，可以将两类细胞型进行区分。 这些结果提供了关于人类神经胶质细胞和视网膜星形胶质细胞中已知神经胶质标记的差异表达模式的见解.

Using the human neural retina transcriptome atlas for benchmarking

为了证明我们的数据集可以作为基准参考，将自己数据与胎儿的视锥细胞，诱导的多能干细胞形成的视锥细胞进行比较。

图a:相关性分析，结果显示：hiPSC-cone在分化15周后的转录组表达谱与视锥细胞高度相似，与其他的视网膜细胞相似度很低。

• 图b：通过主成分分析，展示数据之间的相关性。hiPSC-cone与胎儿的视锥细胞比较相近。 另一个基准测试，评估成年人体内细胞与体外细胞系之间的差异
• 图c:我们将永生的神经胶质细胞系MIO-M1与我们数据集所有视网膜细胞类型进行了比较。使用scRNA-seq，我们对7,150个MIO-M1细胞进行了分析，归一化后每个细胞具有23,987个读数，对应于3421个检测到的基因。 聚类和t-SNE分析表明，MIO-M1细胞形成了一个cluster，cluster与数据集中的视网膜细胞类型不同。
• 图d和e:相关性分析显示：MIO-M1与星形胶质细胞相似性更高，e展示的是该类细胞中的基因的表达丰度。

scGPS能够将混合群分解cluster（SCORE）并分析cluster之间的关系（scGPS）。scGPS根据预测的基因去定义了亚种群。

这个包有两种算法：SCORE 和scGPS scGPS从一个或多个未知样本的scRNA数据中划分亚群以及这些亚群之间的关系。输入数据集包含混合的、异质细胞。scGPS首先使用SCORE（或CORE V2.0）来鉴定同质的亚群。scGPS可以验证由SCORE标识的子种群（例如，用于与PCA，tSNE和插补方法CIDR的结果进行比较的功能）。scGPS还可以选择maker gene区分亚群以及通过富集分析以注释亚群。

在第二阶段，scGPS选择最佳基因预测并建立可以估计亚种群间过渡分数的预测模型，亚种群间过渡分数是来自一个亚种群的细胞可能过渡到另一亚种群的概率。

来源：简书

作者：王冰