使用monocle包进行pseudotime分析

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monocle是一个专门用于分析单细胞转录组数据的R包，提供了聚类，pseudotime, 差异分析等多种功能，该项目的网址如下

https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/

本文主要介绍使用该R包进行pseudotime分析的步骤，可以分为以下5步

1. 读取数据

monocle包有很多种读取数据的方式，这里只展示了读取Seurat中的对象的方法，代码如下

# 加载需要的R包
library(Seurat)
library(monocle)
# 设置cell ranger输出结果目录
input_dir <- "/scRNA/outs/filtered_gene_bc_matrices/GRCh38/"
# 读取数据
pbmc.data <- Read10X(data.dir = input_dir)
# 创建Seurat中的对象
pbmc <- CreateSeuratObject(raw.data = pbmc.data, project = "10X")
# 将Seurat中的对象转换为monocle识别的对象
cds <- importCDS(pbmc)

在monocle中，用CellDataSet这种class来存储数据，示意如下

2. 预处理

代码如下

cds <- estimateSizeFactors(cds)
cds <- estimateDispersions(cds)

第一行代码用于评估每个细胞的sizefactor, 用于后续归一化；第二行代码计算基因的方差。

通过pData和fData两个函数，可以查看基因和细胞的相关信息，示意如下

3. 筛选基因

筛选基因没有一个固定标准，可以根据自己的需要灵活选择，这里只展示其中一种

disp_table <- dispersionTable(cds)
unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1)
cds <- setOrderingFilter(cds, unsup_clustering_genes$gene_id)

4. 降维分析

使用DDRTree的方法进行降维分析，代码如下

cds <- reduceDimension(
 cds,
 max_components = 2,
 method = 'DDRTree')

5. psudotime分析

代码如下

cds <- orderCells(cds)

运行之后，对于每个细胞，会给出一个pseudotime值，示意如下

可视化的代码如下

plot_cell_trajectory(cds)

降维之后，在二维空间展示细胞pseudotime的分布，可以看到是一个树状结构，除了上述方法外，还可以根据pseudotime的值给细胞赋颜色，代码如下

plot_cell_trajectory(cds, color_by = "Pseudotime")

其实就是将fData中对应的列设置为颜色，如果想要观察不同细胞亚型的分布，可以在fData中新增一列细胞对应的cluster ID, 然后用这一类来设置颜色。

对于pseudotime分析，我们需要明白它的基本输入就是一张基因在细胞中表达量的表格，与细胞的聚类结果无关，只不过在可视化的时候根据聚类的结果填充了颜色而已。

·end·

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