使用ChIPpeakAnno进行peak注释
ChIPpeakAnno是一个bioconductor上的R包，针对peak calling之后的下游分析，提供了以下多种功能
- 查找与peak区域最相邻的基因, 也支持自定义查找的特征，可以是exon,miRNA等
- peak相邻基因的GO富集分析
- 提取peak及其周围区域的序列
在ChIPpeakAnno中，无论是peak区间信息还是基因组的注释信息，都通过toGRanges方法转化为R语言中的GRanges对象，以peak为例，bed格式的内容如下
通过如下代码可以导入该信息
library(ChIPpeakAnno)
bed <- "peaks.bed"
gr <- toGRanges(bed, format="BED", header=FALSE)除了BED格式外，该方法也支持导入GTF格式的信息，只需要修改format参数即可。导入peak信息和基因组注释信息后就可以进行后续分析了。
1. 进行peak之间的overlap分析
当导入了多个样本的peak信息时，可以进行venn分析，用法如下
# 导入A样本的peak
bedA <- "sampleA_peaks.bed"
sampleA <- toGRanges(bedA, format="BED", header=FALSE)
# 导入B样本的peak
bedB <- "sampleB_peaks.bed"
sampleB <- toGRanges(bedB, format="BED", header=FALSE)
# 求交集
ol <- findOverlapsOfPeaks(sampleA, sampleB)
# 绘制venn图
makeVennDiagram(ol)结果示意如下
在进行venn分析时，会发现venn图上的个数加起来并不是输入的peak区间的总数，在默认
2. 提取peak周围的序列
用法如下
library(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19)
seq <- getAllPeakSequence(sampleA, upstream=20, downstream=20, genome=Hsapiens)
write2FASTA(seq, "sampleA.peaks.fa")3. 进行peak motif分析
提取到peak序列之后，可以进行motif分析，用法如下
# 用1号染色体的碱基分布当做背景
freqs <- oligoFrequency(Hsapiens$chr1, MarkovOrder=3)
# oligoLength规定了motif的长度
os <- oligoSummary(seq, oligoLength=6, MarkovOrder=3,
quickMotif=TRUE, freqs=freqs)
zscore <- sort(os$zscore)
# 绘制所有6个碱基组合的频率分布图
h <- hist(zscore, breaks=100, xlim=c(-50, 50), main="Histogram of Z-score")
# 频率最大的碱基组合即为motif的结果
text(zscore[length(zscore)], max(h$counts)/10,
labels=names(zscore[length(zscore)]), adj=1)结果示意如下
还可以通过motifStack这个R包绘制motif的sequence logo, 用法如下
library(motifStack)
pfms <- mapply(function(.ele, id)
new("pfm", mat=.ele, name=paste("SAMPLE motif", id)),
os$motifs, 1:length(os$motifs))
motifStack(pfms[[1]])输出结果示意如下
4. 进行peak注释
首先是peak在基因组各个特征区间的分布比例，用法如下
library(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
aCR<-assignChromosomeRegion(sampleA, nucleotideLevel=FALSE,
precedence=c("Promoters", "immediateDownstream",
"fiveUTRs", "threeUTRs",
"Exons", "Introns"),
TxDb=TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
barplot(aCR$percentage, las=3)输出结果如下所示
然后进行peak关联基因的注释，用法如下
# 准备基因组注释信息
library(EnsDb.Hsapiens.v75)
annoData <- toGRanges(EnsDb.Hsapiens.v75, feature="gene")
# 进行
overlaps.anno <- annotatePeakInBatch(sampleA,
AnnotationData=annoData,
output="nearestLocation"
)
library(org.Hs.eg.db)
overlaps.anno <- addGeneIDs(overlaps.anno,
"org.Hs.eg.db",
IDs2Add = "entrez_id")
pie1(table(overlaps.anno$insideFeature))输出结果示意如下
在使用annotatePeakInBatch进行注释时，默认查找距离peak最近的基因，也可以修改output的值，overlapping代表与peak区域存在overlap的基因，设置成这个值之后就会将与peak区间存在overlap的基因作为关联基因了，此外还有多种取值，适用不同条件，具体可以参考函数的帮助文档。
5. 进行peak关联基因的富集分析
进行完基因注释之，得到peak关联的基因，就可以进行后续的功能富集分析，用法如下
over <- getEnrichedGO(overlaps.anno, orgAnn="org.Hs.eg.db",
maxP=.05, minGOterm=10,
multiAdjMethod="BH", condense=TRUE)ChIPpeakAnno提供了一条完整的peak下游分析功能，包括基因注释，富集分析，motif分析等等，是一个非常强大的工具，以上只是基本用法，更多用法和细节请参考官方文档。
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