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使用HiCUP进行Hi-C数据预处理

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生信修炼手册
发布2019-12-20 13:33:16
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发布2019-12-20 13:33:16
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HiCUP是一款经典的Hi-C数据预处理软件,官网如下

https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/hicup/

数据处理的流程示意如下

首先通过hicup_truncater识别原始序列中的junction reads, 最典型的Hi-C的reads如下所示

R1和R2来自两个不同的fragments, 当然这取决于插入偏度长度和读长的关系,当连接点与fragment两端的距离小于测序读长是,会发生下图所示的情况

其中一端的序列是一个嵌合体序列,这样的序列在后续比对时会被过滤掉。为了保留这部分有效reads,hicup_truncater根据酶切位点的特征来识别所有reads上的连接位点,从而识别上图中的嵌合体序列,并对这样的序列末端进行切割,切除多余的嵌合体序列。切割完之后,这样的序列和普通的R1,R2就一样了,可以进行后续的mapping。

hicup_mapper将双端reads与参考基因组比对,由于Hi-C文库的R1和R2来源于空间结构近的染色质,其线性距离比传统的双端测序插入片段的长度大的多,如果直接进行双端比对,觉得部分reads都比对不上参考基因组,所以这里是对每一端的序列分别比对,然后再进行合并。

hicup_filter对比对上的序列进行过滤,如下图所示

只保留valid di-tags, 其他诸如selft-ligation, Re-ligation等片段都会被过滤掉。

hicup_deduplicator用来去除PCR重复,因为valid reads的多少用来表征染色质互作的频率,PCR重复的reads数量会对这个信息造成干扰,如果不去除PCR重复,junction reads的数目多可能是PCR重复多,不一定是因为染色质交互频率强而导致的reads多。

软件的安装也很方便,直接下载解压缩即可。使用步骤如下

1. 准备参考基因组的索引文件

所有的参考基因组比对软件都需要事先对基因组建立索引,HiCUP支持使用bowtie或bowtie2进行比对,以bowtie2为例,建立基因组索引的方式如下

代码语言:javascript
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bowite2-build hg19.fa hg19

第一个参数是基因组的fasta文件,第二个参数是输出的索引文件的名称。

2. 准备参考基因组酶切位点图谱

采用hicup_digester这个脚本来创建基因组的酶切图谱,基本用法如下

代码语言:javascript
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hicup_digester \
--re1 A^AGCTT,HindIII \
--genome hg19_digester_db \
hg19.fa

根据限制性内切酶识别的位点,将基因组序列进行模拟酶切,得到所有可能的酶切片段。--re1指定切割位点的序列和内切酶的名字,--genome指定输出文件的名称。最终输出的文件名示例如下

代码语言:javascript
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Digest_hg19_digester_db_HindIII_None_09-46-07_17-05-2019.txt
3. 编辑配置文件

首先通过如下命令生成一个配置文件的模板

代码语言:javascript
复制
hicup --example

该命令会生成一个名为hicup_example.conf的文件,在此基础上进行编辑就可以了。在配置中对每个选项都体用了详细的注释,根据需求修改即可。常用的修改的选项如下

代码语言:javascript
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#Path to the reference genome indices
#Remember to include the basename of the genome indices
Index: /bi/scratch/Genomes/Human/GRCh38/Homo_sapiens.GRCh38
#Path to the genome digest file produced by hicup_digester
Digest: /bi/scratch/Genomes/Human/GRCh38/Digest_Homo_sapiens_GRCh38_HindIII_None_14-43-31_10-02-2016.txt.gz
#FASTQ files to be analysed, placing paired files on adjacent lines
s_1_1_sequence.fastq.gz
s_1_2_sequence.fastq.gz

包括基因组索引和酶切图谱的路径,以及需要处理的Hi-C原始fastq文件的路径。

4. 运行

准备好配置文件之后,就可以运行了,用法如下

代码语言:javascript
复制
hicup --config hicup.conf

在输出结果的目录会生成一个html文件,展示了质控的各项指标,内容如下所示

1. Truncating and Mapping
2. Filtering

示意如下,可以看到valid pairs的比例在50%左右

3. Length Distribution
4. De-dupliation

除此之外,输出目录还有很多的文件,其中后缀为hicup_bam的文件包含了最终的de-duplication之后的reads的比对结果,可以用于下游的分析。

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原始发表:2019-05-17,如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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  • 1. 准备参考基因组的索引文件
  • 2. 准备参考基因组酶切位点图谱
  • 3. 编辑配置文件
  • 4. 运行
  • 1. Truncating and Mapping
  • 2. Filtering
  • 3. Length Distribution
  • 4. De-dupliation
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