利用单细胞公共数据对新冠受体ACE2的研究进展

目前对新冠病毒受体ACE2在人体组织中的分布正在不断的进行解析，其中单细胞公共数据对受体在不同细胞中的发现起到关键性作用，下面对有关利用单细胞公共数据对组织细胞中ACE2的研究进展进行汇总。

写在前面，作为一名医学生，当然先要科普一下什么是ACE2，以及ACE2的正常生理功能呀！

什么叫ACE2蛋白？

ACE2蛋白是一类跨膜的糖蛋白，在心脏、肾脏、睾丸、胃肠道等多个组织中都有表达。ACE2的编码基因有一个非常著名的同源基因ACE，ACE是一种血管紧张素转换酶，可以将血管紧张素I转换为有活性的血管紧张素II，从而升高血压。而ACE2的作用则是将血管紧张素I转换成血管扩张剂的形式，进而拮抗血管紧张素的升血压作用，因此ACE2的作用与ACE截然不同，两者共同协调起到平衡血压的作用。

在高血压患者中，发现ACE2的表达量降低。诸多研究表明ACE2在缺血性组织内可能被诱导表达，比如心肌梗死和心脏移植的模型鼠中，ACE2表达明显升高。

SARS病毒感染以及SARS病毒的S蛋白都可以降低ACE2蛋白的表达，并且导致体内的急性肺衰竭。而有研究表明动物实验中，抑制或阻断肾素-血管紧张素通路可以减轻肺衰竭。

ACE2与肺脏

A novel coronavirus (2019-nCov) was identified in Wuhan, Hubei Province, China in December of 2019. This new coronavirus has resulted in thousands of cases of lethal disease in China, with additional patients being identified in a rapidly growing number internationally. 2019-nCov was reported to share the same receptor, Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), with SARS-Cov. Here based on the public database and the state-of-the-art single-cell RNA-Seq technique, we analyzed the ACE2 RNA expression profile in the normal human lungs. The result indicates that the ACE2 virus receptor expression is concentrated in a small population of type II alveolar cells (AT2). Surprisingly, we found that this population of ACE2-expressing AT2 also highly expressed many other genes that positively regulating viral reproduction and transmission. A comparison between eight individual samples demonstrated that the Asian male one has an extremely large number of ACE2-expressing cells in the lung. This study provides a biological background for the epidemic investigation of the 2019-nCov infection disease, and could be informative for future anti-ACE2 therapeutic strategy development.

2020年1月26日，同济大学医学院、同济大学附属东方医院左为教授团队在预印本网站bioRxiv上发表题为Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov 。试图在单细胞水平上揭示下呼吸道才是病毒攻击的靶器官。

公共数据: GEO(GSE122960)

数据分析：

1. 软件：Seurat (version 2.3.4)
2. 筛选：removed the low-quality cells with less than 200 or more than 6,000 detected genes, or if their mitochondrial gene content was > 10%. Genes were filtered out that were detected in less than 3 cells.
3. 降维，聚类

结果分析:

（1）作者首先对来自8位成人供体正常肺组织的43,134个细胞进行聚类分析，根据特异性marker对细胞进行标注，包括II型肺泡细胞（AT2），I型肺泡细胞（AT1），气道上皮细胞（纤毛细胞和Club细胞），成纤维细胞，内皮细胞和各种类型的免疫细胞。上图为其中一位55岁的donor的细胞聚类。

（2）研究结果显示，大约0.64%的人类肺细胞会表达ACE2，而这些细胞中的83%是II型肺泡上皮细胞（AT2）；表达ACE2的II型肺泡大约占所有AT2细胞的1.4%。其他细胞如I型肺泡（AT1）、气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等也会表达ACE2，但是占比极低，且个体间差异较大。

为了进一步了解表达ACE2的特殊人群，作者对ACE2+的AT2细胞与ACE2-的AT2细胞进行比较，获得差异基因并进行GO分析。令人惊讶的是，作者发现ACE2+的AT2细胞与病毒过程相关的GO过程显著富集，包括“病毒过程的正调控”（P值= 0.001），“病毒生命周期”（P值= 0.005），“病毒颗粒的装配”（P 值= 0.03）和“病毒基因组复制的正调控”（P值= 0.04）。 研究结果还显示，ACE2表达与年龄或吸烟状况之间似乎没有关联；但男性表达ACE2的细胞占比似乎比女性高，分别为1.66%和0.44%，显示男性或比女性更易感病毒。

评论：这是利用单细胞数据对ACE2进行解析的第一篇文章，文章内容本身是较为简单的，其中的结论ACE2在少量的AT2细胞中表达，其实我个人在这里还是比较存疑的，虽然一般情况下转录水平和蛋白水平可以呈现很好的正相关，但如果冠状病毒如此困难进入下呼吸道定植去找这样一部分比例很少，占据面积很小的细胞（肺泡中AT1:AT2面积比约为9:1），其实是无法解释疫情传播速度为何如此之快。

ACE2与消化道

Since December 2019, a newly identified coronavirus (2019 novel coronavirus, 2019-nCov) is causing outbreak of pneumonia in one of largest cities, Wuhan, in Hubei province of China and has draw significant public health attention. The same as severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), 2019-nCov enters into host cells via cell receptor angiotensin converting enzyme II (ACE2). In order to dissect the ACE2-expressing cell composition and proportion and explore a potential route of the 2019-nCov infection in digestive system infection, 4 datasets with single-cell transcriptomes of lung, esophagus, gastric, ileum and colon were analyzed. The data showed that ACE2 was not only highly expressed in the lung AT2 cells, esophagus upper and stratified epithelial cells but also in absorptive enterocytes from ileum and colon. These results indicated along with respiratory systems, digestive system is a potential routes for 2019-nCov infection. In conclusion, this study has provided the bioinformatics evidence of the potential route for infection of 2019-nCov in digestive system along with respiratory tract and may have significant impact for our healthy policy setting regards to prevention of 2019-nCoV infection.

2020年1月30日，清华大学长庚医院研究团队在预印本网站bioRxiv上发表题为The digestive system is a potential route of 2019-nCov infection: a bioinformatics analysis based on single-cell transcriptomes的研究内容，试图阐述并揭示消化道也可能作为冠状病毒攻击的靶器官。

公共数据：来源包括Gene Expression Omnibus(GEO;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ，Single Cell Portal(https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell) ，Human Cell Atlas Data Protal(https://data.humancellatlas.org) 。从E Madissoon等人的研究获得食道和肺的单细胞数据，其中包含6个食道和5个肺组织样本。从GSE134520获得3例非萎缩性胃炎和3例慢性萎缩性胃炎患者的胃粘膜样本数据。GSE134809由11例回肠克罗恩病患者的22例回肠标本组成，仅选择其中的非炎性标本进行分析。从Christopher S等的研究获得12个正常结肠样本。

数据分析：

1. QC:expressed genes were lower than 200 or larger than 5000 were removed. percentage of UMIs mapped to mitochondrial or ribosomal genes to be lower than 20% .
2. 数据整合，降维及聚类：食道与肺脏有Seurat的rds,可以直接下载。胃和回肠数据下载后按照Seurat(https://satijalab.org/seurat/) V3.0 workflow进行分析。结肠数据使用R包-LIGER和Seurat，进行分析。

结果分析:

（1）细胞类型的注释。胃肠道系统由食道，胃，回肠，结肠和盲肠组成。在这项研究中，作者分析了4个具有食管，胃，回肠和结肠单细胞转录组的数据集，以及肺的。

在食道中，通过87,947个细胞鉴定出14种细胞类型。超过90％的细胞被分为四种主要的上皮细胞类型：upper, stratified, suprabasal, and dividing cells of the suprabasal layer（图21A；第二篇文章中第一张图的A图，后文图片命名同理。）。食道中的免疫细胞包括T细胞，B细胞，单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞（DC）和肥大细胞。

质控后在胃中鉴定出总共29,678个细胞和10种细胞类型，其中较高比例的是胃上皮细胞，包括胃窦基底膜黏液细胞（GMC），凹腔黏液细胞（PMC），主细胞和肠内分泌细胞（图21B）。非上皮细胞谱系由T细胞，B细胞，髓样细胞，成纤维细胞和内皮细胞组成。

在回肠中鉴定出50,286个细胞和10种细胞类型（图21C）。检测到的细胞类型包括上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞和内分泌细胞。鉴定出的免疫细胞类型是骨髓，CD4+ T，CD8+ T和自然杀伤性T（NKT）细胞，以及血浆和B细胞。在11,218个上皮细胞中，鉴定出5种细胞类型，即吸收性肠细胞，2个吸收性细胞前体细胞，杯状细胞，Paneth细胞和未分化细胞（图21D）。

质控后对来自结肠的所有47,442个细胞进行注释（图21E）。在上皮细胞中鉴定出吸收和分泌的肠细胞。吸收性细胞还包括用于转运扩增（transit amplifying，TA）细胞（TA 1，TA 2）、未成熟肠上皮细胞和肠上皮细胞的亚群。分泌细胞包括细胞前体（分泌型TA，未成熟的杯状细胞）和成熟细胞（杯状细胞和肠内分泌）的亚群，在最终的UMAP中也鉴定出了神经节细胞和循环TA细胞。

图21

（2）鉴别ACE2特异性表达的细胞。就胃而言，ACE2的表达在所有cluster中都相对较低（图22B，C）。至于食道，ACE2在upper和stratified上皮细胞中高度表达（图23B，C）。腺体中ACE2的表达也很低（图23C）。在回肠的上皮细胞中，ACE2在吸收性肠上皮细胞中高表达，而在吸收性前体细胞中表达较少，与结肠中的表达情况相似（图24B，C）。在结肠中，ACE2主要存在于肠上皮细胞中，在未成熟肠上皮细胞中较少表达（图25B，C）。然后作者用肺脏作对照，在肺中鉴定出57,020个细胞和25种细胞类型（图26A）。细胞类型包括纤毛的1型肺泡（AT1）和2型的肺泡（AT2）细胞，以及成纤维细胞，肌肉和内皮细胞，T，B和NK细胞，以及巨噬细胞，单核细胞和树突状细胞（DC）。ACE2主要在AT2细胞中表达，也可以在AT1和成纤维细胞中发现表达（图26B）。

在正常消化系统和肺中所有表达ACE2的细胞中，回肠和结肠中ACE2的表达高于肺和食道中的ACE2表达（图26C）。

图22

图23

图24

图25

图26

评论：这个文章围绕食道的不同细胞中ACE2的表达进行分析，说明了消化系统可能也是冠状病毒的一种潜在传播方式，并在生物信息学方面提供了证据。其实，结合我最近对ACE2分析来看，这几种细胞的共同特点（1）都处于上皮的最表面，与病毒接触可能性较大；（2）均在分化成熟的细胞中表达较高，这个在我做分析时也看到了，尤其是上皮细胞。为什么在成熟的上皮细胞中需要高表达ACE2还是只是一个随机高表达，ACE2是否还有其他的生理学功能，这些问题值得思考。

ACE2与肝脏

A newly identified coronavirus, 2019-nCoV, has been posing significant threats to public health since December 2019. ACE2, the host cell receptor for severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS), has recently been demonstrated in mediating 2019-nCoV infection. Interestingly, besides the respiratory system, substantial proportion of SARS and 2019-nCoV patients showed signs of various degrees of liver damage, the mechanism and implication of which have not yet been determined. Here, we performed an unbiased evaluation of cell type specific expression of ACE2 in healthy liver tissues using single cell RNA-seq data of two independent cohorts, and identified specific expression in cholangiocytes. The results indicated that virus might directly bind to ACE2 positive cholangiocytes but not necessarily hepatocytes. This finding suggested the liver abnormalities of SARS and 2019-nCoV patients may not be due to hepatocyte damage, but cholangiocyte dysfunction and other causes such as drug induced and systemic inflammatory response induced liver injury. Our findings indicate that special care of liver dysfunction should be installed in treating 2019-nCoV patients during the hospitalization and shortly after cure.

2020年2月4日，由复旦大学附属中山医院肝癌研究所等机构合作完成，在预印本网站bioRxiv上发表题为Specific ACE2 Expression in Cholangiocytes May Cause Liver Damage After 2019-nCoV Infection的研究内容，试图揭示部分SARS和2019-nCoV患者伴有肝脏损伤是由于胆管细胞中表达ACE2所引起。

公共数据：9位大肠癌患者（GEO124395）

数据分析：

QC,细胞聚类：removed cells with less than 200 genes or more than 5000 genes, as well as cells with mitochondrial content higher than 20% ，resolution=0.8。

结果分析：

图31

（1）为了评估ACE2的细胞类型特异性表达，作者首先分析了已发布的数据集，其中包含来自9位大肠癌患者（GEO124395）的正常肝脏样品的scRNA-seq数据（图31A，B和C）。在胆管细胞和肝细胞中发现了相较稀疏的ACE2表达。相反，在免疫细胞和基质细胞中未观察到ACE2表达（图31D）。观察结果部分与先前基于蛋白质表达的数据一致，即肝中的Kupffer细胞和内皮细胞均为ACE2阴性。scRNA-seq鉴定出肝细胞中ACE2表达的比例较低。

图32

（2）为了验证以上结果，作者对4位健康donor的肝脏进行单细胞分析。从11550个细胞鉴定出16种细胞类型，发现在胆管细胞簇的大部分（59.7％的细胞）中ACE2的表达显著富集。与上面分析的公共数据集相似（图31D），该结果证实免疫和基质细胞均为ACE2阴性（图32D）。作者观察到肝细胞中ACE2的低表达（2.6％），平均表达水平比胆管细胞的表达水平低20倍。胆管细胞中ACE2的表达可能暗示了病毒感染和直接破坏胆管的潜在机制。

评论：作者做到这里就说明胆管细胞中的ACE2的表达可能是肝损伤的原因其实是蛮玄学的，如果这样成立的话，那么只要表达ACE2，并且只要部分患者出现了该器官的异常指标反应，都可以归结为这种可能性，该结论尚需进一步的实验验证。其实，用药对人体机体反应的干扰巨大，尤其是在大量用药对肝肾负担极重，如果出现ALT/AST的功能异常往往先去考虑用药，在排除用药方面的影响后才会考虑其他方面。

ACE2与人体系统

To date, it has been known that, similar to SARS-CoV, the novel coronavirus 2019-nCoV originated from Wuhan (China) invades human cells via the receptor angiotensin converting enzyme II (ACE2); and the lung cells that have the ACE2 expression may be the main target cells during 2019-nCoV infection. However, in addition to the respiratory symptoms, some patients also exhibited not-respiratory symptoms such as kidney failure, which implies that 2019-nCoV could also invade other organs. To construct a risk map of different human organs, here we analyzed the single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) datasets derived from major human physiological systems including respiratory, cardiovascular, digestive and urinary systems. By interrogating the scRNA-seq data, we not only identified the organs such as lung, heart, oesophagus, kidney, bladder and ileum to be risky, but also can locate the specific cell types such as type II alveolar cells (AT2), myocardial cells, proximal tubule cells of kidney, ileum and oesophagus epithelial cells, and bladder urothelial cells, which are vulnerable to 2019-nCoV infection. Based on the findings, we finally 3 constructed a risk map indicating the vulnerability of different organs to 2019-nCoV infection. This study may provide the potential clues for further investigating the pathogenesis and route of 2019-nCoV infection.

2020年2月8日，上海交通大学系统生物医学中心研究团队于Frontiers of Medicine 发表题为The single-cell RNA-seq data analysis on the receptor ACE2 expression reveals the potential risk of different human organs vulnerable to Wuhan 2019-nCoV infection的研究内容，试图构建易受2019-nCoV冠状病毒侵犯的人体器官风险分布图。

公共数据：样本包括呼吸系统，心血管系统，消化系统和泌尿系统部分器官的10套单细胞数据的分析 （GSE122960 ， GSE121600 ，GSE106118 ，GSM3972018 ，GSM3954949 ，GSE115469 ， GSE109564 ，GSM3723358 ， https://www.tissuestabilitycellatlas.org/）

数据分析：Seurat V3.0，其中肾脏resolution设置为0.5，其他分辨率设置为0.1。

结果分析：

（1）肺AT2细胞和呼吸道上皮细胞显示ACE2高表达。作者首先分析了来自鼻粘膜，呼吸道，支气管和呼吸系统肺的scRNA-seq数据集。在8个人中，ACE2阳性的AT2细胞的平均比例约为1％，标准偏差为1％。因此，作者定义ACE2阳性细胞比例大于1％的细胞类型为高风险；含有＜1％ACE2阳性细胞的细胞类型是低风险的。有趣的是，来自呼吸道样本的呼吸道上皮细胞含有约2％ACE2阳性细胞，因此，呼吸道被认为是高风险的（图41）。但是，从鼻和支气管样本中获得的细胞几乎没有显示出ACE2高表达，因此风险较低。

图41

（2）心肌细胞高表达ACE2。人体心脏的scRNA-seq数据显示，心脏中超过7.5％的心肌细胞具有ACE2阳性表达（图42），这暗示心脏可能处于2019-nCoV感染的高风险中，特别是在血液中存在病毒或在病毒血症的情况下。

图42

（3）回肠和食道上皮细胞具有较高水平的ACE2表达。我们从消化系统（包括食管，胃，回肠和肝脏）中探索了scRNA-seq数据。有趣的是，在回肠上皮细胞中发现了极高的ACE2表达（约30％ACE2阳性细胞，图43），因此回肠可能具有高风险。ACE2阳性食管上皮细胞超过1％，因此，食道可被视为高风险（图44）。相反，来自胃和肝的细胞显示出较低的ACE2表达水平。

图43

图44

（4）肾近端小管细胞和膀胱尿路上皮细胞表达ACE2。作者还分析了泌尿系统肾脏和膀胱的scRNA-seq数据。值得注意的是，在肾近端小管（PT）细胞中发现了较高的ACE2表达，其中ACE2阳性细胞的比例约为4％（图45）。此外，ACE2阳性细胞在膀胱尿路上皮细胞中的比例为2.4％（图46）。因此，在病毒血症中，肾脏和膀胱均被视为高危人体器官。

图45

图46

基于以上发现，可以构建不同器官的2019-nCoV感染相关风险图（图47）。由于临床意义，应将肺为最高风险。有趣的是，除了肺AT2以外，来自呼吸道，肾脏，食道和膀胱，回肠和心脏的某些细胞类型中超过1％的细胞群也表达ACE2，因此这些器官应被视为2019-nCoV的潜在高风险感染对象。这一发现可能解释了在2019-nCoV肺炎患者中观察到的非呼吸系统症状。

图47

评论：尽管病毒往往首先经由呼吸道侵染到肺部，但是随着病情的进展，尤其是病毒血症的出现，病毒也有可能经由循环系统感染更多的人体内部器官，这可能与患者后期出现肾衰竭和心肌炎等症状有关。同时，该研究结果也提示病毒有可能借助尿液和粪便传播。

总结

其实至此，ACE2的单细胞分布分析基本上就已经解析完了，说实话是糙了点。其实很多数据是具有一定的数据依赖性的，如果某种细胞在捕获总数设置的就是不很高，然后在亚群中捕获某一特定的细胞亚群可能就会存在困难，但基于数据我们可能认为本身不存在，所以需要及时验证数据分析信息的真实性。

表达ACE2就一定容易感染吗？这个问题其实是有待商榷的，只能说通过受体进行感染，但病毒后期的cell cycle宿主细胞是否都有也是需要考量的；我曾经看过一篇文献，题目我给忘啦（耍流氓，哈哈哈），里面比较经典的实验就是从中华菊头蝠中分离出的SARS-like冠状病毒，用来侵袭其他物种蝙蝠时，即使大量表达ACE2也不能在该bat中增殖感染，说明可不是仅仅看看ACE2的有无和亲和力与否那样简单。

| 文章作者：Tiger | 文章校对：生信宝典