单细胞转录组技术梳理（二）

分享是一种态度

前言

上次分享了2009年汤老师的第一篇单细胞转录组研究文章中的测序方法

在这之后，许多更灵敏、更准确的单细胞转录组技术如雨后春笋般相继被开发出来。今天继续来回顾一下2011年的单细胞转录组测序技术 STRT（Single-cell tagged reverse transcription ）。文章是：Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq

STRT

每个样本都是通过将单个细胞挑取到预装有裂解缓冲液的96孔PCR板中，然后加入反转录试剂来产生cDNA第一链。每个孔中加入8个合成mRNA作为内部对照。为了使反应孔结合一个特定的barcode(即使细胞特异)，STRT利用了逆转录酶模板切换机制，在每个反应孔的辅助寡核苷酸指导cDNA 3'端引入一段特异性序列（带有6bp barcode）。cDNA合成完成后，将96孔板的反应产物在同一试管中混合、纯化，在单管中进行单引物PCR扩增。这样就减少了细胞间的扩增偏差，并且可以保持较低的PCR循环次数。然后对扩增的样品进行Illumina测序。该过程命名为 STRT 。

具体流程

1. 用oligo-dT寡核苷酸引物(绿色)逆转录mRNA(棕色)，产生cDNA第一链，并且在3'端添加了3-6个C(胞嘧啶)；
2. 模板转换：将辅助寡核苷酸(helper oligo , 绿色)引入到cDNA中。辅助寡核苷酸由6bp barcode(阴影)和引物序列构成，从而在cDNA中引入条形码和引物序列。【加入的template-switching oligonucleotide（TSO）引物，由于在合成时携带3个RNA碱基G，会同第一链cDNA末端多加的C碱基杂交，顺理成章地将模板转换成第一链cDNA，而不是再使用RNA酶将RNA降解后使cDNA上位为模板。这样，我们就有了双链的cDNA】；
3. 利用模板抑制效应，通过单引物PCR扩增产物，然后将其产物固定在珠子上、片断化和末端加A尾；
4. 将Illumina P2接头(蓝色)连接到cDNA自由端；
5. 使用P1序列引物(蓝色)在文库PCR步骤中引入P1接头；
6. 最后使用定制引物从P1侧对最终文库进行测序。每次读取(箭头)都以条形码开始，然后是3~6个C，然后是mRNA插入序列。