一文了解TooManyCells
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1. TooManyCells 简介
- TooManyCells 是由宾夕法尼亚大学的 Gregory W. Schwartz 等人开发的一种聚类算法，开发的本意是用于 scRNA-seq 数据的分析，当然也可以用于任意的以 observations 为列，以 features 为行的数据
- 相关文献：TooManyCells identifies and visualizes relationships of single-cell clades(https://www.nature.com/articles/s41592-020-0748-5?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg) 发表在 Nature Methods
- 据我了解，该算法有 2 种包装形式，一种是
too-many-cells软件，一种是TooManyCellsRR 包，由于 R 包报错问题尚未解决，所以本教程只涉及too-many-cells软件 - 参考 github 文档
- https://github.com/GregorySchwartz/tooManyCellsR?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg
- https://github.com/GregorySchwartz/too-many-cells
2. 软件安装
下面仅介绍一种安装方式，更多方式请见 github 文档
- 可以选择用 conda 安装 curl
- 用 curl 安装 stack
## 安装 stack
curl -sSL https://get.haskellstack.org/ | sh #这个 curl 可以用 conda 安装
stack setup- 用 stack 安装 too-many-cells
## 安装 too-many-cells
git clone https://github.com/GregorySchwartz/too-many-cells.git
cd too-many-cells
stack install- 完成后打开
nohup.out看到最后提示将/blabla/.local/bin路径加入 PATH 变量，因为这是软件的安装路径
3. 文件架构
个人习惯，project 下建三个文件夹：
- scpt，用于存放脚本；
- input，用于存放输入信息；
- out，用于存放输出信息
4. 关于常规表达矩阵转 cellranger 结果
- 一开始由于我的疏忽，以为这个软件只能读取 cellranger 结果中的 3 个文件这样格式的输入文件，但我手头只有普通表达矩阵，在向曾老师求助之后他很快发了推文：表达矩阵逆转为10X的标准输出3个文件
- 从这段非常秀的代码中我学到这么几点：
- R 中的“常规写入”
file="matrix.mtx"
sink(file)
cat("%%MatrixMarket matrix coordinate integer general\n")
cat("%\n")
sink()tmp=do.call(rbind,lapply(1:ncol(ct),function(i){
return(data.frame(row=1:nrow(ct),
col=i,
exp=ct[,i]))
}))5.默认参数
- 但是，在我又读了一遍 github 文档之后，发现输入既可以是一个文件夹（里面放 cellranger 的 3 个文件），也可以是一个 csv 格式的普通表达矩阵…于是还是采用后者读取数据
- 除了表达矩阵之外，还需要一个输入文件
labels.csv，大致长下面这个样子：
如果已知细胞有不同的来源，或者数据分析之后对细胞有注释需求都可以通过这个输入文件实现
- 代码
too-many-cells make-tree \
--matrix-path ../input/expr_count.csv \
--labels-file ../input/labels.csv \
--draw-collection "PieRing" \
--output ../out \
> ../out/clusters.csv- 对于我的需求来说最后的输出只有两个文件有用，一个是
clusters.csv，记录聚类结果，一个是dendrogram.svg，可视化聚类结果 - 可视化效果：
6. “修剪”树枝
- 显然，默认参数下的分支太细了，我们可以通过两种方式来调整
- 直接设置 --min-size 参数为一个值，如 100，以规定最小分支细胞数
- 设置 --smart-cutoff 参数为一个值，如 4，以规定最小分支细胞数为 4*median absolute deviation，这个我还不太明白，但是我猜测这是根据每个分支的情况决定分支大小，可能会更合理
- 代码
too-many-cells make-tree \
--prior ../out \
--labels-file ../input/labels.csv \
--smart-cutoff 1 \ #经调试，我的数据最合适的值是1
--min-size 1 \
--draw-collection "PieChart" \
--output ../out_pruned \
> ../out_pruned/clusters_pruned.csv- 可视化结果：
- 只有一种颜色是因为我的 labels 只标了一种，如果 labels 有多种，那么就会呈现这样的效果：
7. 取细胞子集
- 如果有取出一部分有一定特点的细胞进一步分析，就需要用到
clusters_pruned.csv了 - 首先查看这个文件的结构
$ head clusters_pruned.csv
cell,cluster,path
AAACGGGAGGTGTTAA.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AACACGTTCGGCGGTT.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AACCGCGGTATATGAG.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
ACACCCTTCTGGTTCC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
ACCTTTAAGGTGTTAA.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
ACGAGGACACGTTGGC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AGGGAGTCAGGCTCAC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AGGGATGAGCGATAGC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AGTGGGAAGATGTAAC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0- 看来是通过数字的形式记录 cluster 信息的，并且记录了从小到大的每一个分支，但是这个数字和图怎么对应呢？可以把数字标出来
too-many-cells make-tree \
--prior ../out \
--labels-file ../input/labels.csv \
--smart-cutoff 1 \
--min-size 1 \
--draw-collection "PieChart" \
--draw-node-number \ #只需多加这个参数
--output ../out_pruned \
> ../out_pruned/clusters_pruned.csv- 结果：
- 那么接下来就可以取任意分支的所有细胞的 barcodes 并由此去除该细胞子集的表达信息了
8. 其他可视化选项
- 由于我没有这些需求，所以这里仅仅是搬运 github 文档
8.1. 分支末端画成饼图
- 代码
too-many-cells make-tree \
--prior out \
--labels-file labels.csv \
--smart-cutoff 4 \
--min-size 1 \
--draw-collection "PieChart" \
--output out_pruned \
> clusters_pruned.csv- 可视化结果：
8.2. 调整树枝宽度
- 代码
too-many-cells make-tree \
--prior out \
--labels-file labels.csv \
--smart-cutoff 4 \
--min-size 1 \
--draw-collection "PieChart" \
--draw-max-node-size 40 \
--output out_pruned \
> clusters_pruned.csv- 可视化结果：
8.3. 不按分支大小缩放
- 代码
too-many-cells make-tree \
--prior out \
--labels-file labels.csv \
--smart-cutoff 4 \
--min-size 1 \
--draw-collection "PieChart" \
--draw-max-node-size 40 \
--draw-no-scale-nodes \
--output out_pruned \
> clusters_pruned.csv- 可视化结果：
9. 体现特定基因表达量
- 代码
too-many-cells make-tree \
--prior ../out \
--matrix-path ../input/expr_count.csv \
--labels-file ../input/labels.csv \
--smart-cutoff 1 \
--min-size 1 \
--feature-column 2 \
--draw-leaf "DrawItem (DrawThresholdContinuous [(\"gene1\", 0), (\"gene2\", 0)])" \
--draw-colors "[\"#e41a1c\", \"#377eb8\", \"#4daf4a\", \"#eaeaea\"]" \
--draw-scale-saturation 10 \ #如果不加这个参数，很可能表达量普遍较低以至于整张图没有颜色，至于这个值多少比较合适我还没有试过
--output ../out_gene_expression \
> ../out_gene_expression/clusters_pruned.csv- 可视化结果：
10. 任意分支之间的差异分析
- 比如我想比较上图中两根蓝色（也就是 gene1 高表达，gene2 低表达）的分支，一看他们的 cluster 号码分别是 110 和 148（当然可以直接空缺一个数字，表示比较一个分支和其他所有细胞）
- 代码
too-many-cells differential \
--matrix-path ../input/expr_count.csv \
-n "([110], [148])" \
+RTS -N24
> ../out/differential.csv11. diversity
- 比较两个细胞群的多样性（需要先跑过 make-tree 得到结果）
- 代码
too-many-cells diversity\
--priors ../out1 \
--priors ../out2 \
-o ../out_diversity_stats12. 伪时序分析
- 代码
too-many-cells paths\
--prior ../out \
--labels-file ../input/labels.csv \
--bandwidth 3 \
-o ../out_paths- 结果：
- 个人认为还是用 slingshot 吧…
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原始发表：2020-03-19，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除
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