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单细胞转录组技术梳理(一)

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谈起单细胞转录组测序就不得不提到北京大学汤富酬教授,2009年,汤富酬老师在博士后期间发表了世界上第一篇单细胞mRNA测序的文章“mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell”,自此正式拉开了单细胞转录组的大门。下面我们来回顾一下汤富酬在这篇文章中提出的方法。

  • 细胞裂解:在显微镜下人工吸取单个细胞并裂解
  • cDNA合成:带有锚定序列(UP1)的poly(T)引物将mRNA反转录成cDNA
  • primer去除:消化未使用的引物
  • 末端加尾:将Poly(A)尾巴添加到cDNA第一链的3'端
  • 合成cDNA第二链:使用带有另一个锚定序列(UP2)的ploy(T)引物合成第二链cDNA
  • PCR扩增:用UP1和UP2引物通过PCR均匀扩增cDNA
  • cDNA打断:将扩增后的cDNA打断
  • 加接头:将P1和P2接头连接到打断的序列片段末端
  • 文库扩增:将文库与共价连接P1引物的1mm直径beads混合进行乳液PCR(emulsion PCR:其实是一个注水到油的独特过程)

emulsion PCR

乳液PCR的最大优势就是能够让低浓度DNA在独立反应空间,经过大量PCR循环使目的片段呈指数扩增,而没有其他的竞争性或污染性序列的影响。其关键技术是“注水到油”(水包油),基本过程是在PCR反应前,将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面,水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下,每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列,因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂,所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增,并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后,可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。经过反应,DNA模板的拷贝数量呈指数扩增,每个小片段都将被扩增约几百万倍,从而达到测序所要求的DNA量。

本文分享自微信公众号 - 单细胞天地(sc-ngs),作者:单细胞天地

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原始发表时间:2020-03-10

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