10x Genomics解读成人视网膜的单细胞转录组图谱

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文章信息

今天带来的这篇文章2019年8月发表在期刊The EMBO journal（IF:11.227）上，题为A single-cell transcriptome atlas of the adult human retina 。

总 · 览

视网膜是一种特殊的神经组织，可以感知光线并启动图像处理。为了全面剖析人类视网膜，作者使用10x Genomics单细胞转录组测序技术，对来自三位捐献者的20,009个细胞进行了单细胞RNA测序，并编制了参考转录组图谱。使用无监督的聚类分析，确定了在转录上不同的18种细胞群，它们代表所有已知的神经视网膜细胞：视杆感光细胞，视锥细胞感光细胞，Müller胶质细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞，水平细胞，星形胶质细胞和小胶质细胞。另外，作者揭示了在捐献者死后时间较长的情况下分子MALAT1表达的丧失，这可能暗示了MALAT1在杆状光感受器变性中的新作用。

生信分析主要方法

1. cellranger pipeline用于将原始下机的BCL文件转换为fastq文件 。
2. 为了从fastq文件生成读取计数矩阵，作者使用了cellranger count，使用STAR aligner将高质量的读取映射到转录组（GRCh38），并执行UMI计数。
3. 使用cellranger聚合函数（aggr）合并了五个文库并归一化了样本间文库大小的差异。
4. 用Seurat对测序文库进行质量控制，以去除异常细胞和基因。
5. 使用LogNormalize方法进行了其他细胞间的归一化处理，并回归了由线粒体基因表达和每个细胞的唯一分子标识符（UMI）数量引起的固有变异.
6. 使用基于图的共享最近邻方法（SNN），对前20个主要成分的PCA减少的表达数据进行0.6分辨率的聚类， 聚类结果使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE）可视化。

样本

捐献者死后15个小时之内的神经视网膜细胞

主要结果

人神经视网膜单细胞转录组鉴定主要细胞类型

作者合并了来自三个神经视网膜样品的五个scRNA-seq结果进行处理和分析。从23,000个细胞中，平均每个细胞获得40,232个读数，每个细胞获得1,665个UMI（唯一转录本）。在使用Seurat软件包进行质量控制和过滤之后，最终数据集包含20,009个细胞。图A显示，作者采用无监督聚类方法将这些细胞分成18个群。图B显示样本来源的分布。图CD显示，作者根据已经报道的marker基因鉴定得到9种类型的细胞。

健康且退化的人体杆感光受体亚群分析

接下来作者分析了14759个杆状光感受器细胞。图A显示，杆状光感受器细胞已知的7个marker在6个亚群中的差异表达情况。图B显示，许多杆状光感受器细胞群来自单个供体，这可能是由于样本批次差异造成的。接下来，作者进一步定义和分类杆状光感受器细胞的异质性，作者发现MALAT1是一种长非编码RNA，在视网膜稳态和疾病中起作用。图的B-D显示了MALAT1在杆状光感受器细胞中的表达有高低的区别。作者使用RNA原位杂交方法验证了这一结果，图E。

前面提到了可能会有批间差，因此作者用CCA工具来矫正。

人类视网膜中视锥细胞及胶质细胞的转录组图谱分析

接下来作者分别根据marker基因分析了视锥细胞及胶质细胞数据。

使用人类神经视网膜转录组图谱进行基准测试

作者为了证明实验结果数据集可以作为基准参考，比较了使用其他方法生成的不同细胞类型的scRNA-seq图谱，包括胎儿的人类视锥细胞感光细胞、人类诱导的多能干细胞衍生的视锥细胞感光细胞（hiPSC-cone）以及具有139个细胞的成年人类视网膜样本。分析表明，成年人类视网膜样品显示出与杆状感光器细胞最高相似性，hiPSCcone分化15周后的转录组显示出与视锥细胞感光细胞的相似度最高（0.63），而与所有其他视网膜细胞类型的相似度较低，特别是，hiPSC-cone与胎儿锥型感光体和成人锥型感光体的相似性很高（分别为0.71和0.61），而与成人杆状感光体的相似性低得多（0.33）。这些结果证实hiPSC-cone向视锥细胞直接分化具有较好的质量，且诱导分化的视锥细胞与成人相比更接近胎儿来源。