分享是一种态度
inferCNV
用与探索肿瘤单细胞RNA-seq数据,分析其中的体细胞大规模染色体拷贝数变化(copy number alterations, CNA), 例如整条染色体或大片段染色体的增加或丢失(gain or deletions)。工作原理是,以一组"正常"细胞作为参考,分析肿瘤基因组上各个位置的基因表达量强度变化. 通过热图的形式展示每条染色体上的基因相对表达量,相对于正常细胞,肿瘤基因组总会过表达或者低表达。
inferCNV
提供了一些过滤参数,通过调整参数来降低噪音,更好的揭示支持CNA的信号。此外inferCNV
还包括预测CNA区间的方法以及根据异质性模式定义细胞类群的方法。
尽管inferCNV
是一个R包,但是在安装inferCNV之前还需要先下载安装JAGS ,好在它有Windows,MacOS和Linux版本,所以inferCNV
在各个平台都能用。
Windows和MacOS的JAGS容易安装,而Linux的JAGS需要编译
1# 手动安装BLAS和LAPACK不推荐
2# yum install blas-devel lapack-devel
3tar xf JAGS-4.3.0.tar.gz
4cd JAGS-4.3.0
5./configure --libdir=/usr/local/lib64
6make -j 20 && make install
安装R包
1install.packages("rjags")
2if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
3 install.packages("BiocManager")
4BiocManager::install("infercnv")
此外,利用
conda seach infercnv
能够检索到"bioconductor-infercnv", 因此如果没有root希望在服务器上安装的话,可以尝试用conda。
测试安装
1library(infercnv)
2
3infercnv_obj = CreateInfercnvObject(raw_counts_matrix=system.file("extdata", "oligodendroglioma_expression_downsampled.counts.matrix.gz", package = "infercnv"),
4 annotations_file=system.file("extdata", "oligodendroglioma_annotations_downsampled.txt", package = "infercnv"),
5 delim="\t",
6 gene_order_file=system.file("extdata", "gencode_downsampled.EXAMPLE_ONLY_DONT_REUSE.txt", package = "infercnv"),
7 ref_group_names=c("Microglia/Macrophage","Oligodendrocytes (non-malignant)"))
8
9infercnv_obj = infercnv::run(infercnv_obj,
10 cutoff=1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics
11 out_dir=tempfile(),
12 cluster_by_groups=TRUE,
13 denoise=TRUE,
14 HMM=TRUE)
如果没有报错,就说明安装成功。
需要准备3个输入数据
第一个是Genes x Cells的表达矩阵(matrix),行名是基因,列名是细胞编号。
第二个是样本注释信息文件,命名为"cellAnnotations.txt"。一共两列,第一列是对应第一个文件的列名,第二列是细胞的分组
2MGH36_P6_F03 Microglia/Macrophage
3MGH54_P16_F12 Oligodendrocytes (non-malignant)
4MGH54_P12_C10 Oligodendrocytes (non-malignant)
5MGH36_P1_B02 malignant_MGH36
6MGH36_P1_H10 malignant_MGH36
第三个是基因位置信息文件,命名为"geneOrderingFile.txt"。一共四列,第一列对应第一个文件的行名,其余三列则是基因的位置。注:基因名不能有重复
1WASH7P chr1 14363 29806
2LINC00115 chr1 761586 762902
3NOC2L chr1 879584 894689
4MIR200A chr1 1103243 1103332
5SDF4 chr1 1152288 1167411
6UBE2J2 chr1 1189289 1209265
最复杂的工作就是准备输入文件,而一旦上述三个文件已经创建完成,那么分析只要两步以及根据结果对参数进行调整。
第一步,根据上述的三个文件创建inferCNV
对象
1infercnv_obj = CreateInfercnvObject(raw_counts_matrix=matrix, # 可以直接提供矩阵对象
2 annotations_file="cellAnnotations.txt",
3 delim="\t",
4 gene_order_file="gene_ordering_file.txt",
5 ref_group_names=c("normal"))
这一步的一个关键参数是ref_group_name
, 用于设置参考组。假如你并不知道哪个组是正常,哪个组不正常,那么设置为ref_group_name=NULL
, 那么inferCNV
会以全局平均值作为基线,这适用于有足够细胞存在差异的情况。此外,这里的raw_count_matrix
是排除了低质量细胞的count矩阵。
第二步,运行标准的inferCNV
流程。
1# perform infercnv operations to reveal cnv signal
2infercnv_obj = infercnv::run(infercnv_obj,
3 cutoff=1, # use 1 for smart-seq, 0.1 for 10x-genomics
4 out_dir="output_dir", # 输出文件夹
5 cluster_by_groups=T, # 聚类
6 denoise=T, #去噪
7 HMM=T) # 是否基于HMM预测CNV
关键参数是cutoff
, 用于选择哪些基因会被用于分析(在所有细胞的平均表达量需要大于某个阈值)。这个需要根据具体的测序深度来算,官方教程建议10X设置为0.1,smart-seq设置为1。你可以先评估下不同阈值下的保留基因数,决定具体值。cluster_by_groups
用于声明是否根据细胞注释文件的分组对肿瘤细胞进行分群。
最终会输出很多文件在out_dir
的目录下,而实际有用的是下面几个
Infercnv::run
的参数非常之多,总体上分为如下几类
你可以按照具体的需求修改不同步骤的参数,例如聚类默认cluster_by_groups=FALSE
会根据k_obs_groups
聚类成指定的组数,而层次聚类方法用于计算组间相似度的参数则是hclust_method
.
此外,设置HMM=TRUE
的计算时间会长于HMM=FALSE
,因此可以先设置HMM=FALSE
快速查看结果。
在运行过程中它会显示每个步骤的信息,官方文档给出了示意图帮助理解。
InferCNV_procedure
inferCNV
会输出一个" map_metadata_from_infercnv .txt"文件用于记录每个细胞的元信息,所有信息都可以从该文件中进行提取。或者使用infercnv::add_to_seurat
将信息直接增加到原来的seurat对象中。
关于inferCNV
的算法原理在如下几篇文章中有说明