单细胞测序下的骨髓微环境

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文章信息

今天分享的文章于2019年4月发表于Nature，文章利用单细胞转录组联合突变分析研究急性髓性白血病（AML），揭示AML病人体内存在不同功能子集及其相关的驱动因子。文章标题：The bone marrow microenvironment at single-cell resolution

摘 · 要

在本研究中，在体内平衡和应激诱导的造血条件下分别构建了小鼠骨髓血管，血管周围和成骨细胞群的单细胞转录组图谱。该研究揭示了骨髓龛中先前未被认可的细胞异质性水平和阐明了造血生长因子，趋化因子和膜结合配体的细胞来源。我们的研究表明，在压力条件下，包括血管周围细胞的脂肪细胞倾斜在内的骨髓龛的转录重塑相当大。应激条件下，观察到由DIl1和DIl4编码的血管Notch delta样配体基因表达下调。在无血管DII4基因存在的情况下，造血干细胞会过早地诱导髓样特征的转录进程。以上这些发现重塑了人们对骨髓龛细胞结构的认知，揭示对压力极其敏感的动力学和异质性分子图谱，同时表明单细胞转录组数据在评估离散龛细胞群体在造血功能的调节中的效用。

背景

造血-产生成熟血细胞的过程-对于发挥各种功能至关重要，例如氧运输，免疫防御和组织重塑。这一相当大的工作由罕见的自我更新造血干细胞（HSCs）维持，该干细胞维持在由瘦蛋白受体阳性（LEPR +）的间充质基质细胞和血管内皮细胞组成的特化骨髓微环境中。先前已提出成骨细胞支持早期淋巴祖细胞存活和维持。交感神经纤维细胞，巨噬细胞，巨核细胞和非髓鞘化施万细胞提供额外的信号（细胞因子），这也有助于HSC龛。前期的研究表明，骨髓结构中存在有血管细胞和间质干细胞介导的更深程度的细胞复杂性。必须以精确和快速的方式控制造血，来满足体内稳态和环境压力条件的不同需求。尽管我们对骨髓龛的理解在过去几十年中已经有了很大的发展，但是解决骨髓微环境的分子异质性和功能可塑性的研究任然有限，这主要是由于骨髓中靶标细胞的数量太少及分离技术的局限性。在本研究中，我们分析了小鼠骨髓龛中的17,374个单细胞，识别出了骨髓微环境中以前未被认识到的异质性，并揭示了微环境是如何在单细胞水平对急性骨髓应激作出反应。我们将转录分析与荧光报告基因和功能研究相结合，来证明我们的单细胞研究所鉴定的Notch受体DLL4的血管表达抑制了HSC中髓样程序的过早上调。

测序数据介绍

文库构建：The libraries were prepared using the Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits (v2): Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v2 (PN-120237), Single Cell 3′ Chip Kit v2 (PN-120236) and i7 Multiplex Kit (PN-120262) (10x Genomics) 61 , and following the Single Cell 3′ Reagent Kits (v2) User Guide (manual part no. CG00052 Rev A). Libraries were run on an Illumina HiSeq 4000 as 150-bp paired-end reads, at one full lane per sample。

分析了小鼠骨髓龛中的17,374个单细胞的转录组。

数据分析情况

• 数据过滤：Sequencing results were demultiplexed and converted to FASTQ format using Illumina bcl2fastq software. The Cell Ranger Single-Cell Software Suite was used to perform sample demultiplexing, barcode processing and single-cell 3′ gene counting.
• 比对: 参考基因组mm10/GRCm38 reference genome
• 基因过滤：使用Seurat R软件包进行数据过滤，识别高可变的基因，降维分析，标准的无监督聚类算法，获得差异表达基因
• 细胞过滤：除去基因数量小于1000的低质量细胞和含有超过10%线粒体基因的细胞
• 可视化：使用t-SNE，基于对齐的典型相关分析降维，在二维空间中细胞投影。
• 聚类分析：Aligned canonical correlation analysis was also used as a basis for partitioning the dataset into clusters using a shared nearest neighbour modularity optimization algorithm.
• 数据获得：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE108892

主要分群情况

识别正常骨髓样品种的细胞类群

作者识别出两个内皮、4个血管周围和3个骨细胞系的细胞亚群及一个小的（70）个增殖细胞簇 (Fig. 1c, d, Extended Data Fig. 1e)。作者仅关注骨髓龛的大的细胞亚群，还可以用于其他分析（数据挖掘党的福音）。作者分别分析了内皮细胞亚群、管脉细胞亚群和骨细胞系亚群的特征和相关基因的检测。

Fig. 1

Fig.2

鉴于LEPR+细胞群体具有多谱系分化潜能和间充质干细胞活性，该细胞群体的异质性一直是个悬而未决的问题。作者通过综合分析从LEPR+细胞群体中识别出4个明显的簇（P1、P2、P3、P4）。P1 (Mgphigh )和P2(Lplhigh ) 簇表达成脂相关的标记基因。

分析正常组的LEPR+细胞群体有明显的和3个（P1、P3和P4）簇，结合分析处理组得到P2簇（一个成脂前体细胞状态而非一个祖细胞）。P3 (Wif1high) 和P4 (Spp1highIbsphigh)为LEPR+细胞群体中成骨蓄势待发的类群，因为成骨相关的基因的表达水平随着时间日益增高。LEPR+细胞群体表达P3和P4簇的特异性基因标记CD200（由Cd200编码）和CD63（由Cd小梁63编码），该标记主要位于骨部分。

COL2.3+细胞类群可以由其转录本分为三个亚群。簇O1（Col16a1highTnnhigh）表达高水平的破骨细胞（由Ostn编码）和血管生成素样2（由Angptl2编码），以及DEL-1（由Edil3编码），其最近研究已证明其可调节骨髓细胞生成。亚群O2（Fbn1highIgf1high;扩展数据图5a）既表达成骨细胞也表达软骨细胞特异性基因。簇O2与表面标记CD9相关。由于簇O3（BglaphighCar3high）显示出COL2.3（Col1a1）和成骨相关基因的最高表达，它代表成熟的成骨细胞（图2c）

骨髓龛的应激反应特征

常用于治疗白血病的化学疗法会导致造血祖细胞的消耗，并诱导其他静默状态造血干细胞的增殖和分化。骨髓消耗影响窦状血管和基质细胞，并导致骨髓脂肪细胞的增加。为了研究急性应激条件下骨髓龛的动态分子和形态变化，作者给予单剂量的5-氟尿嘧啶（150 mg.kg -1）。在治疗后第5天，检测到骨髓细胞数，Lineage（Lin）-SCA-1 +CD117 +（LSK）骨髓细胞以及骨髓血管和血管周围细胞总数的显着下降。

为了追踪应激性造血过程中骨髓龛中基因表达的变化，我们用5-氟尿嘧啶处理了7,752个细胞（图3）

Fig. 3

结果表明脂肪细胞引发的簇（P5，n = 161）（图3b）的形成以及整个LEPR+和COL2.3+群体中簇贡献的变化。

5-氟尿嘧啶处理后的LEPR+细胞群体，脂肪相关的基因表达上调，成骨相关的基因表达下调。

5-氟尿嘧啶处理后对造血因子的影响。上调的基因有：vascular Ang, perivascular Il7 and Bmp4 and osteo Wnt5a；下调的的基因有：vascular Notch delta-like ligands Dll4 and Dll1, the adhesion molecule Sele and perivascular Wnt4。(图5)

临床意义

越来越多的证据表明偏离了传统的造血分层模型，而是建议每个HSC能够区分不同的血统。很有可能这样的可塑性是由HSC和微环境的组成部分之间的独特相互作用决定的。我们的研究结果通过提供骨髓生态位的不同血管，血管周围和骨系组成部分的详细转录蓝图，扩展了对骨髓生态位的理解。本研究，结果表明单细胞转录组分析可以转化为机制明了干细胞和祖细胞分化的调节。作者将造血因子与其细胞来源相匹配，并显示血管-内皮细胞表达的Notch配体DLL4的缺失使骨髓造血倾向于HSPC的显著的转录重编程和髓样发生。将来的研究需要研究骨髓龛异质性对功能异常干细胞的影响，如免疫缺陷，造血系统恶性肿瘤和衰老。靶向骨髓龛相关因子可能干扰疾病的发生和发展，最近已经有研究通过靶向急性淋巴细胞白血病中的血管CXCR4-CXCL12相互作用显示出来。