骨髓龛中不同细胞群体的关联性及其分化途径

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文章信息

文章利用单细胞转录组分析骨髓龛中不同细胞类群间的相关性及其分化轨迹中不同的转录调控因子的功能。文章于2019年7月7日发表在Cell reports 杂志，文章连接，DOI：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.06.031。文章标题是：Mapping Distinct Bone Marrow Niche Populations and Their Differentiation Paths。

摘 · 要

骨髓微环境是由复杂表型和细胞成熟轨迹未知的异质性的非造血细胞群体组成。在这些非造血细胞群体中，间充质细胞维持产生间质细胞，骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。阐明骨髓内这些独特的细胞亚群仍然具有挑战性。本研究中，我们使用非造血骨髓细胞的单细胞RNA测序来定义特定的细胞亚群。此外，通过结合细胞状态层次的计算预测和已知的关键转录因子的表达，我们绘制了针对骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞谱系的分化途径。 最后，我们使用谱系特异性报告菌株和靶向敲除来验证我们发现的基因。 我们的分析揭示了成熟基质细胞的分化层次，确定了伴随这些分化轨迹的关键转录因子，并增加了对骨髓微环境复杂性的理解。

样品制备

使用scRNA-seq来分析正常8至16周龄C57BL/6小鼠的非造血细胞和非上皮细胞。用长骨的研磨和胶原酶 - 分散酶处理的组合制备单细胞悬浮液，然后分选活的CD45- Ter119-（非造血细胞）和CD31-（非内皮细胞）细胞。通过流式分选选取骨髓细胞样品中的非造血、非表皮细胞，选取CD45, Ter119和CD31阴性细胞。通过3'基于液滴的scRNA-seq（inDrops）分析分选的细胞（图1A）。

测序数据介绍

采用 inDrops方法进行 单细胞测序，稍加改进 。

建库和测序：For the in vivo samples, two libraries (n = 1,533 cells total) were prepared for mouse 1 and three libraries (n = 3,574 cells total) were prepared for mouse 2.

For the three cultured samples, one library per sample was prepared (n = 2,837, n = 2,164, and n = 2,520 total cells, respectively).

NextSeq 500进行测序

数据分析情况

• 数据过滤：原始数据按照Zilionis et al., 2017描述的方法进行，生信分析流程inDrops.py除去低质量的reads。细胞过滤：
• 比对: Bowtie v.1.1.1 参考基因组是the Ensembl release 85 Mus musculus GRCm38 reference.

然后使用总计数标准化的变体对每个细胞的基因表达计数进行标准化，以避免来自非常高表达的基因的变形。

• 细胞过滤：Each library was initially filtered to include only abundant barcodes (> 500 total counts for all in vivo libraries; > 800 counts for cultured sample 1; > 1,000 counts for cultured samples 2 and 3), based on visual inspection of the histograms of total transcript counts per cell barcode。
• 基因过滤：Next, we excluded putatively stressed or dying cells with > 30% (in vivo samples) or > 20% (cultured samples) of their transcripts coming from mitochondrial genes.
• For the in vivo samples, we also used Scrublet(Wolock et al., 2019) to identify two clusters of cell doublets that co-expressed marker genes of distinct cell types. 142 putative doublets were excluded.
• 聚类和可视化：We repeated cell clustering and visualization using only the non-hematopoietic, non-endothelial clusters. Gene filtering, PCA, and kNN graph construction were performed as above, except only the top 25 principal components were used, and only seven spectral clusters were generated.
• 表达矩阵可以下载：GSE132151

主要分群情况

识别骨髓微环境中的细胞类群

小鼠重复样品中的5,107个细胞（中值为1,651个分子和每个细胞1,085个基因），样本间基因表达或细胞类型丰度没有显著差异。去除双联体，并除去造血细胞和内皮细胞，我们使用剩余的2,847个细胞（每个细胞的1,394个分子的中位数和736个基因）进行下游分析。聚类分析显示出7个聚类（P1-P7）并鉴定出每个聚类中富集的基因（图1B），我们使用基因集富集分析来表征来自每个细胞状态的最重要的基因表达特征（图1C）。不同聚类的细胞群体表达与细胞粘附，细胞因子产生，HSC支持，脂肪生成和骨化有关的基因。各个聚类中某些单细胞高表达的基因也可以预测该聚类的表达模式（图1D）。用SPRING可视化单细胞转录组，揭示了形成两个主要分支的连续细胞状态（图1E）。

间质细胞的异质性

基于上述分析和先前的阐明的骨髓基质细胞基因的表达模式，我们细胞状态标记分配给单细胞转录组数据集的每个聚类（图1E和2A）。这些骨髓基质细胞包括多能间充质干细胞，并且在单细胞数据集中最丰富的类群。脂肪细胞祖细胞（AdPs）和前脂肪细胞，成骨细胞/软骨细胞祖细胞（OsPs），前成骨细胞 - 软骨细胞（Pre-OCs），成骨细胞和软骨细胞。由于样本制备过程中使用的胶原酶和分散处理及细胞分选会刺激转录因子表达改变 (van den Brink et al., 2017)。因此，选取与应激特征无关的其他转录因子基因（例如，Ccl2，Ccl7，Nr4a3，Adipoq，Icam1）来识别脂肪细胞聚类（图2B和S2A）。此外，我们还描述了重要的骨髓龛调节因子（图2C），转录因子和其他基因的表达，这些基因定位于不同的谱系（图2D）。

基质和祖细胞分化的转录因子轨迹

鉴定调节基质细胞类型分化的转录因子之前，我们首先推断出这些细胞在分化时的基因表达轨迹。MSCs被认为会产生骨骼，脂肪和软骨，这得到了Velocyto (La Manno et al., 2018) 和我们数据的支持 (Figure 3A)。Velocyto将MSCs鉴定为我们数据集中最强的“来源”细胞状态，前脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞作为可能的最终状态(Figure 3B)。然后我们使用群体平衡分析（PBA),来预测细胞的平均基因表达轨迹。平均基因表达轨迹将MSCs与这些最终状态区别开来 (Figure 3C) 和基于它们的表达模式的聚类基因沿着各自的分化轨迹(Figure 3D)。识别出成骨、软骨和脂肪分化的转录因子。

使用细胞命运标记报告基因确证基质细胞亚群

为了确证基于单细胞转录组分析识别的细胞类型和转录调控因子，采用荧光酶素的标记的小鼠间质细胞进行实验验证。

识别基质细胞亚型及其潜在的细胞谱系

通过敲低实验验证成骨、成软骨和成脂分化相关的转录因子的功能，揭示出转录因子在基质细胞命运决定中的重要作用。

临床意义

本研究中，我们阐明了基质细胞直接分化成成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞的转录过程。研究产生的scRNA-seq基因表达谱可以实时描述骨髓微环境中及其命运选择相关的动态过程。这项研究的主要结果是详细描述了骨髓间质细胞的三种不同的分化路径。我们确定了每条分化路径的中间体细胞类群，这些中间体细胞类群可以被前瞻性地选择来测试其分化谱系的潜力。最后，我们发现这些群体与细胞命运标记的所显示的谱系是一致的，并且它们预测的分化潜能在培养中被展现出来。

近年来，在稳态和疾病期间表征基质细胞群方面取得了重大进展，我们的研究为更好地理解调节骨髓微环境细胞分化的转录网络提供了一个广泛的视角 (Hoggatt et al., 2016, Méndez-Ferrer et al., 2010, Mercier et al., 2011, Morrison and Scadden, 2014, Tikhonova et al., 2019, Baryawno et al., 2019)。基质细胞的失调与一些病理生理过程相关，如肥胖、骨质减少、骨质疏松、癌症、牙齿脱落和衰老(Engblom et al., 2017, Medyouf et al., 2014, Mendelson and Frenette, 2014, Raaijmakers et al., 2010, Zambetti et al., 2016) 。因此，理解调节间质细胞分化的机制可能导致对这些疾病的发病机理的进一步了解，并最终获得新的治疗方法。

我们的拟时分析结果以及转录验证支持亚群之间的关系，并允许我们探索基质细胞表型的转录层次。虽然scRNA-seq工具不断进步及其应用的不断扩展，转录组扫描并不能提供细胞状态的完整视图 (Cieślik and Chinnaiyan, 2018, Kumar et al., 2017)。因此，采用多模态分析有助于获得更深入的理解，因为这些技术具有测量多种分子表型的能力。此外，理解MSCs命运决定的进展将需要使用炎症和疾病模型以及基于我们初步发现的患者样本进行更深入的研究。我们在这里展示了用命运图和报告菌株验证scrna-seq数据的重要性。同样的模型也可以在微扰过程中进一步研究特定转录因子在谱系承诺决策中的意义。

总之，本研究对骨髓微环境的细胞组成和向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞脂肪的分化途径的转录中间产物提供了重要的见解。此外，尽管体内和培养的基质细胞之间存在显著的差异，但体外分化实验证明有助于分析转录因子与不同基质命运的相关性。我们的数据集和分析将作为研究基质细胞分化的未来研究的资源。