单细胞测序技术将彻底改变整个生物科学

今天介绍的是一篇单细胞综述，发表于2013年的Nature reviews genetics ，预测了如今单细胞技术的火热。文章题目是：Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science。

核心 · 观点

• DNA测序技术的发展使得能够分析单细胞的基因组和转录组，并且很快将实现单细胞表观基因组学和蛋白质组学分析。
• 单细胞基因组分析可揭示单个细胞之间的基因组变异性，并用于以谱系树的形式重建细胞祖先。
• 单细胞转录组分析可用于研究单个细胞的功能状态并以无偏差的方式推断和发现细胞类型。
• 基于高通量测序整合单细胞分析，将能够同时分析细胞的基因组，转录组学和表观基因组。这些数据将揭示细胞的类型及其祖细胞，并以它们的当前功能状态，推断它们的祖细胞的类型和功能状态。
• 单细胞综合分析，将揭示生物学和医学的基本问题，包括癌症起源和发生，人类细胞类型的数量和关系，以及再生组织中细胞更新的速率和结构。

正文

Methods for single-cell isolation-单个细胞的分选方法

生物体有成千上万种细胞类型，有多种方法可以从生物体组织中分离出单个的细胞。（主要分为随机和靶向分离两种）

分离细胞是单细胞研究中最困难的步骤之一。目前的单细胞分离策略主要分为三类：

• 手动分离、
• 荧光激活的细胞分选
• 微流体技术。

在进行单细胞转录分析之前，我们需要确定自己拿到了正确的细胞。

• 如果你想要的细胞已经处于悬浮状态（比如循环肿瘤细胞），而且含量相对比较丰富，那么流式细胞分析将是你的理想选择。
• 如果样本是实体组织，我们可以用酶分解掉胶原和其他细胞外蛋白。不过酶学消化对细胞影响较大，甚至可能改变基因转录情况。把组织细胞制成悬液之后，我们就可以通过特异性的荧光标签分离出自己想要的细胞。进一步拿到单细胞是比较棘手的一步，可能需要用到微流体设备。将细胞分散到悬液中，会失去它们在组织里的位置信息。
• 如果你想要了解单细胞所处的环境，就得使用激光捕获显微切割技术。这种技术通过扫描组织切片定位目的细胞，并将其提取出来。操作者需要非常小心，以免切到细胞或细胞核。数量最为稀少的细胞只能用毛细管等器具手动获取。

从实体组织中分离单个细胞关键两步：

• 第一步，（单个细胞）通常是用酶解的方式把离体或者活体分解成单个的细胞；
• 第二步，单个的细胞必须在单个的反应器中进行裂解和进一步的分析。

四种方式获得单个细胞及其优缺点（Table 1）：

• 显微操纵（精密控制）（micromanipulation）
• 荧光激活的流式分选：flow sorting using fluorescence-activated cell sorting (FACS)
• 激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection，LCM）http://www.tj3zx.cn/system/2016/06/27/012259863.shtml
• 微流体技术（microfluidic device）

Single-cell genomics

基于体细胞突变重建细胞谱系图

最初，人们认为同一个个体不同的细胞具有完全相同的基因组的观点证明是错误的。体细胞分裂时DNA的复制不可能绝对精确无误-引起体细胞突变。体细胞突变从受精卵阶段开始积累，这些突变具有很高的几率赋予我们身体中的每个细胞具有独特的基因组特征。体细胞独特的基因组信号可以构建精度很高的细胞谱系。人类生物学和医学中尚未解决的核心问题实际上是关于人类细胞谱系树的问题：它在发育，生长，更新，衰老和疾病中的结构，动力学和变异性。完全了解每个细胞中积累的独特体细胞突变将允许我们以极高的精度重建细胞谱系树。

癌细胞谱系重建将阐明其发展过程

细胞谱系重建癌症将阐明其发展。癌症患者通常不会死于肿瘤的发生，而是死于癌症转移。然而，尽管进行了数十年的研究，关于转移灶起源于何处的关键问题尚未得到彻底的阐述（图2）。转移癌细胞的来源癌症病灶中的任何一个细胞还是来自于不肿瘤亚克隆？或是来自于肿瘤干细胞？或者是转移来自肿瘤细胞和正常移动的巨噬细胞融合形成的杂合体？化疗后癌症复发的原因，可能是普通肿瘤细胞随机逃避化疗引起的？癌细胞谱系对解答这些问题至关重要。

早期的实验分析了每个细胞中的几个关键标记。在最近的一个例子中，通过荧光原位杂交（FISH）测定单个细胞中多达8个染色体畸变及其组合的发生率，来研究了急性淋巴母细胞白血病的异质性和肿瘤起源。这使得在癌症进展过程中可以分析亚克隆结构。最近，使用数百个单核的测序产生个体乳腺癌细胞的近似拷贝数分布，从而重建肿瘤群体结构和进化历史。在另一项研究中，对患有骨髓增生性肿瘤的患者的全外显子组进行单细胞测序，以重建肿瘤祖细胞并识别出候选驱动突变。

使用二代测序构建的体细胞突变谱系示踪，已经在体内大量细胞群体中得到了证实，但对于单个细胞尚无报道。且bulk测序不能显示，关于突变或畸变的不同组合的准确信息，解决此类问题有待构建癌细胞的单细胞谱系分析

通向单细胞基因组学的道路

虽然，现在对细胞群体的DNA进行测序已经变得很容易，但对来自单细胞的DNA进行测序仍然是一个挑战。尽管最近通量有所提高，获得足够深度的多个单细胞测序分析的成本仍然很高，这已经成为限制大规模应用单细胞基因组学，转录组学和表观基因组学的阻力。

单细胞转录组学

细胞群的分子状态

给定异质细胞群，测量关键因子的平均值，例如基因型，RNA输出或目标基因座的表观遗传状态，仅提供系统状态的部分表征。不幸的是，用于量化细胞群的分子状态的大多数方法，从转录分析到蛋白质组学，是基于通过平均单个细胞的信号来估计数百万个细胞的集合中的平均行为。例如，不可能基于微阵列或RNA测序（RNA-seq）数据确定基因表达的细胞间差异，或确定信号蛋白的中间水平是否是双峰或均匀种群内的结果。基于标准蛋白质组学的分布。超越基于平均值的细胞群表征需要在不同尺度上平衡采样细胞的数量和功能覆盖的完整性（表2）。

单细胞转录组的应用

单细胞转录组学的应用。单细胞转录组学的一个主要应用是分析稀有细胞类型。例如，可以从患者血液中获得循环肿瘤细胞，但是通常每个血液样品仅分离少量细胞，并且这些细胞通常会被更多数量的正常细胞污染。单细胞RNA-seq可用于区分这些细胞类型，同时从肿瘤中获得表达数据。类似地，根据定义，早期人类胚胎仅包含稀有细胞类型，其仅存在于瞬时。关于早期发展的关键问题可以使用转录组学来解决。在这种情况下，转录组学具有能够使用序列多态性（例如，SNP）来区分衍生自两个亲本基因组中的每一个的转录物的优点。另一个将从单细胞转录组学中获益的领域是成体干细胞的研究，这种干细胞通常很少见，有时只是短暂存在，并且可以与其他细胞类型混合。然而，通过使用单细胞RNA-seq，可以简单地通过从组织中取无偏倚的细胞样品来广泛地采样每种细胞类型。单个细胞的大小，形态，发育起源和功能特性差别很大。然而，尽管在某些特定情况下取得了进展，但我们目前对细胞类型，其起源，进化和多样性的理解程度还不够。

单细胞转录组学之路

通往单细胞转录组学的道路。尽管单分子DNA 和RNA 测序取得了进展，但尚不可能直接从单细胞中测序RNA。目前，RNA需要转化为cDNA并进行扩增，这必须以最小的损失实现，并且不会引入太多的定量偏差。

在单细胞转录组实验中存在几种噪声源。全局（即，影响细胞中RNA的总量）和局部（例如由于共调节或大规模染色质修饰）存在生物学波动。还存在技术噪音，例如由于移液误差，温度差异，测序深度的差异，PCR扩增偏差和逆转录效率的差异。重要的是要认识到单细胞转录组分析也是单分子分析，因为许多基因仅在每个细胞的少数mRNA分子中表达。

单细胞表观组和蛋白组

显然，细胞的基因组和转录组仅捕获其部分状态，并且细胞的大部分功能由其表观基因组和蛋白质组决定，这增加了群体中细胞的多样性。单细胞转录组学的另一个应用领域是转录波动的表征。RNA含量的动态变化与循环过程相关，例如细胞分裂和昼夜节律的细胞周期。其他波动是随机的，反映了转录是由许多概率步骤组成的离散过程的事实。通过细胞分裂时细胞内容的不均匀分配引入了进一步的异质性。大量单细胞的直接转录组分析应该开启对未受干扰的细胞群中振荡和随机调节过程的研究。在假定相同的细胞群中，可以鉴定多组共同调节的基因。每组必须是功能过程的一部分，例如振荡器或随机过程。

结论

单细胞是生命的基本单位。因此，单细胞分析不仅仅是更进一步地迈向更敏感检测，而且是对生物学更基本原理理解质的飞跃。在这里，我们描述了基于单细胞测序分析的最新进展。这些进展包括单个细胞的基因组和转录组测序，我们预测很快就可以在数千甚至数百万个细胞中的核酸完成全基因组测序。此外，我们也描述了如何将细胞现象转换为基于DNA序列的读数。例如，可以通过ChIP-seq将诸如组蛋白修饰的表观基因组标记转化为DNA信号。类似地，蛋白质修饰和相互作用可通过邻近连接测定法转化为DNA信号。

DNA测序的海量信息及其不断增长的势头，意味着许多不同的细胞现象可转化为DNA读出。这种融合的结果应该允许多种模态的综合测量。这种整合的可行性已经在基因组学和转录组学分析中得到证实，并且同时分析单细胞中的DNA，RNA和蛋白质可用于定量描述分子生物学的中心法则。尽管单细胞分析方法正在快速发展，但在单细胞整合分析中同时分析多种特性仍待开发。细胞特性之间的生化差异导致分析它们的方法需要改变。并有待开发通用性的单细胞多特性分析测量。这种整合单细胞遗传，表观遗传，转录和蛋白质组学的分析方法（图1），将允许构建多个分子标记之间的关系，无偏见的识别复杂细胞群结构，直接或间接表征其之间的因果关系。开发复杂的单细胞遗传分析方法可以更好地理解这些细胞特性，并重新定义“细胞类型”的概念。这种整合的可行性已经在基因组学和转录组学分析中得到证实。

最后，在发育过程中单个细胞的突变的积累，可以用于推断每个细胞的祖细胞。虽然细胞命运图描述了特定状态下细胞的下一潜在状态，但并不能获得它们的精确谱系关系。相比之下，使用体细胞突变重建细胞谱系树，不但能获得细胞间的谱系关系，还可以提供它们祖细胞的状态信息。我们预计，对单细胞进行的综合分析将为推动小鼠和人类等高等生物研究发展提供动力。如果采样细胞的状态 - 由它们的转录组和表观基因组决定，并且可由它们的蛋白质组进一步增强 - 构成重建细胞谱系树的叶子，那么可以精确的知道，其祖细胞的状态；由谱系树内部节点可以形式化为数学模型。这将允许扩展重建范围来描述其状态改变的动态，并将细胞谱系树与细胞命运整合在一起。

高等生物的细胞谱系树可以回答人类生物学与医学中的许多开放性问题，并且有可能将医学转变为个性化的诊断和治疗。大约十年前，就有人提出，单细胞基因组学的发展可能会开启“人类细胞谱系项目”，并以重建整个人类细胞谱系树为目的。我们相信，对单细胞测序技术的回顾和发展将使我们更接近实现这一目标，并将彻底改变整个有机体科学。