单细胞技术揭示平滑肌细胞表型调节和TCF21疾病基因在抗动脉粥样硬化过程中的作用

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单细胞天地小编：火烧甜蛋茶

今天带来的这篇文章是2019年8月发表在Nature Medicine上，题为Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis。

总览

为了响应各种刺激，血管平滑肌细胞（SMC）可以在表型调节的过程中去分化，增殖和迁移。但是尚不清楚动脉粥样硬化期间体内调节性SMC的表型以及该过程对冠状动脉疾病（CAD）风险的影响。作者使用单细胞RNA测序技术，全面表征了小鼠和人类动脉粥样硬化病变中调节性SMC在体内的转录表达，并发现这些细胞能够转化为独特的成纤维细胞样细胞，称为“成纤维细胞”，而不是经典细胞巨噬细胞表型。TCF21-a（一种致病性CAD基因）的SMC特异性基因敲除显著抑制了小鼠的SMC表型调节，从而导致损伤内以及损伤保护性纤维帽内的纤维细胞的减少。此外，在患者的人冠状动脉中，TCF21的表达与SMC表型调节密切相关，而在人CAD相关的组织中，较高的TCF21表达水平与降低的CAD风险相关。这些结果确立了TCF21和SMC表型调节在这种疾病中的保护作用。

主要实验方法

流式细胞术、10xChromium单细胞转录组建库（Illumina HiSeq 4000仪器测序 ）、CITE-seq(与10x文库合并用Illumina HiSeq 4000仪器测序 ）、免疫组化、RNAscope原位RNA检测技术、ChIP-Seq 。

PS：CITE-seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing）通过测序来进行转录组和表位的细胞索引技术的新型测序技术，能够对数千个单细胞的表面蛋白标记物进行测定，同时还能够对相同单细胞中的信使RNA进行测序。

样本

小鼠从主动脉根和上升主动脉分离的细胞，两组：tdT+（SMC origin细胞）和 tdT-（所有其他细胞）

人类动脉粥样硬化性冠状动脉的离体细胞

主要结果

单细胞RNA测序（scRNA-Seq）定义了小鼠动脉粥样硬化的细胞组成，并显示Tcf21表达在SMC表型调节过程中被上调

小鼠在高脂饮食（HFD）和疾病发作之前接受它莫西芬治疗时，所有SMC（以及随后增殖产生的任何后代）都被tdT荧光标记。为了检测单细胞基因表达，作者使用了流式细胞术将从主动脉根和升主动脉分离出的细胞分为两组：tdT +（SMC起源）和tdT-（所有其他细胞类型）。用10x 技术分别在两组细胞上进行scRNA-Seq，然后将所有时间点的tdT +和tdT-数据集合并分析。图a-c：t-SNE 图分群显示，8周高脂，16周高脂饮食后的测序结果可以看出SMC表型转化类群逐渐出现（粉红色群）。图d可视化所有已被FACS分类为tdT +并因此为SMC谱系的细胞，发现该疾病相关细胞簇中的绝大多数细胞都是SMC衍生的。图e列出了定义a-c中每种细胞簇类型的前8个基因。 每个圆圈的大小代表每个簇中表达每个基因至少一个检测到的转录本的细胞比例。图f：Tcf21+细胞在不同细胞类型细胞群中的占比。

疾病期间体内的SMC表型调节导致其形成特定的成纤维细胞样细胞

图2a-g显示了SMClin小鼠在所有时间点的数据。在表型调节的SMC簇中，SMC分化的标志物包括转胶蛋白（Tagln，图b）和钙蛋白（Cnn1，图c）显示来自亲代SMC谱系的递减表达梯度，以及Lgals3（ SMC表型调节的已知标记，图d），表明这些细胞正在经历SMC表型调节。在该细胞组中，还有许多其他基因显着上调，包括纤连蛋白1（FN1，图e），骨保护蛋白（Tnfrsf11b；图f）和胶原蛋白1α1(Col1α1 ）。图中结果还显示了细胞类群变化的方向。作者还用IPA分析方法分析了SMC转化过程中差异基因富集到的通路。

Tcf21在SMC中的缺失抑制了表型调节

为了确定Tcf21对SMC表型调节的作用，作者在SMC特异性条件性Tcf21基因敲除小鼠（SMClin-KO）的主动脉根和升主动脉中进行了scRNA-Seq。作者在16周疾病时间点的scRNA-Seq数据中测量了收缩性SMC和纤维细胞的比例，发现与SMClin对照的SMC相比（图a），SMClin-KO小鼠的SMC减少了 进行表型调节的能力（图b）。在疾病的8周和疾病16周时均观察到SMC调节的降低（图c）。较大群小鼠的主动脉根部斑块特征支持了scRNA-Seq的发现。提示该基因敲除能够显著抑制小鼠中SMC的表型转化现象。

人冠状动脉中的SMCs显示了相似的纤维细胞表型

为了明确是否可以在人类中观察到在小鼠中的发现，作者在人类动脉粥样硬化性冠状动脉的离体细胞中进行了scRNA-Seq。将四个心脏移植受者的右冠状动脉内的病变部分解离并进行scRNA-Seq。图中结果显示，根据每个簇中最重要的定义基因来区分细胞类型。作者还用Seurat包将小鼠与人的数据联合分析，发现这种方法可以将每个物种的已知直系同源细胞类型准确地聚在一起。

总结

本研究使用单细胞转录组测序技术，分析了小鼠和人类动脉粥样硬化病变动脉中存在SMC的表型转化，并且发现这些细胞转化为独特的成纤维细胞样细胞，被称为"纤维肌细胞"，而不是传统认为的经典的巨噬细胞表型。SMC中特异性敲除TCF21 基因对小鼠SMC表型转化的影响。该研究使用的分析方法比较特别，将小鼠和人的数据放在一起分析，感兴趣的同学可以仔细研究研究~