单细胞揭示人胎儿肝造血图谱

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文章信息

本期文章题目是：Decoding human fetal liver haematopoiesis. 发表于2019年10月9日的Nature

摘要

胎儿肝造血作用对造血干细胞与多能祖细胞的自我更新和分化有重要影响。作者利用scRNA-seq检测了约14万个肝脏细胞、7.4万个皮肤、卵黄囊和肾脏细胞，鉴定出了人类发育过程中的血液和免疫细胞的变化过程：他们从HSC/MPPs群中推断细胞分化轨迹，评估组织微环境对血细胞和免疫细胞发育的影响。作者发现：胎儿皮肤中存在生理性红细胞生成；卵黄囊中存在肥大细胞、NK细胞、先天淋巴细胞前体存在；在妊娠过程中，胎儿肝脏的主要造血成分发生变化，不再以红细胞为主；同时伴有HSC/MPPs分化潜能的平行变化。

胚胎原始血细胞和免疫细胞来源于胚外组织，在受孕2-3周（PCW）后由卵黄囊产生；3-4周后主动脉-性腺-中肾小管（AGM）祖细胞开始产生。卵黄囊和AGM祖细胞在肝脏等胎儿组织中定植，肝脏承担胎儿主要的造血功能直至孕中期。胎儿骨髓在11 PCW 左右开始定植，20 PCW 后成为造血主要部位。卵黄囊、AGM、胎儿肝和骨髓衍生的免疫细胞，包括其周围的非淋巴组织，其成熟过程均由组织微环境所决定。

该研究采用scRNA-seq，绘制了7-17 PCW 胎儿肝脏细胞分子状态，并通过实验对转录表型进行验证。此外，通过比较胎儿肝中的免疫细胞与卵黄囊中的免疫细胞以及皮肤和肾脏中的典型NLTs，构建了胎儿免疫发育网络。

胎肝单细胞转录组概况

作者制备了7-17 PCW 胚胎和胎肝单细胞悬液以研究胎肝血液及免疫细胞的发育变化。用 FACS 分选 CD45+ 和 CD45− 细胞，送 10x 和 smart-seq2 单细胞测序。为了综合评估 NLTs 和卵黄囊中血液及免疫细胞状态，同时分选了胎儿皮肤、肾脏和卵黄囊细胞。

实验设计

分选策略

总体来看，肝脏细胞分选138,575个，另有小部分用来做smart-seq2，皮肤细胞分选54,690个，肾脏细胞9,643个，卵黄囊细胞10,071个用于测序。 对胎肝单细胞数据，作者采用了Louvain（基于层次聚类的图聚类）方法对细胞进行聚类，同时鉴定了相应差异基因。为了尽可能去除批次效应同时保留生物学变化，作者利用Harmony对采自四个阶段的样本数据进行了校正整合：

校正后

取样四阶段性别混合胎肝样本

不同阶段胎肝细胞组成

作者将胎肝细胞分为27类，VCAM1+ 成红细胞血岛中心巨噬细胞由于与周围红细胞互作而被单独归为一类细胞；所有类型的细胞在各发育阶段均被发现，但是各阶段数目不等。此外，样本未检出中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，这与粒细胞出现自胎儿骨髓造血时期的现象相吻合；样本早期以红细胞为主，晚期则淋巴细胞与骨髓细胞增多。

各阶段细胞动态变化

数据集可靠性验证

作者筛选了在所有clusters中均差异表达的48个基因(log(fold change) > 0.5)，随后用这48个基因通过随机森林预测细胞states，精确率和召回率均值达到89%。接着作者利用编码细胞不同表面蛋白基因对细胞进行分离，用smart-seq2 对分离细胞进行了简单验证；FACS分离的细胞在形态学上与野生型细胞一致。

48 genes in cell states

流式分离细胞与对照吉姆萨染色情况，(细胞根据上图星标marker分选得到)

接下来作者观察了红系细胞、肥大细胞、髓系细胞和淋巴细胞的空间分布，肝脏基本结构在8-17 PCW 间逐渐形成；虽然环绕门静脉和中央静脉的肝小叶尚不能被明显区分，但是总体肝组织呈增加态势；造血岛浮现于血窦及周边肝组织中，血窦CD68+ 巨噬细胞被血型糖蛋白A红系细胞包裹；来自B细胞系的CD1c+树突细胞和CD79a+、CD20+细胞零散分布。从scRNA-seq 表达谱来看，这些细胞总体更接近造血细胞（21、22、23）而与肝细胞距离较远（27）；这可能与体外分离的肝细胞较为脆弱且高表达线粒体基因有关。以上工作皆为验证该数据集的准确性而开展。

组织空间结构分析

胎肝及NLT造血作用分析

随后作者推断出了造血发生轨迹。运用力导向图算法，作者鉴定出了以HSC/MPP为中心的三个连接对象：红系细胞-巨核细胞-肥大细胞、B 细胞/先天淋巴细胞/T淋巴细胞、髓系细胞；随后用PAGA算法佐证了这一结果。

轨迹分析

PAGA结果 基因动态修饰在红系细胞、肥大细胞、巨核细胞三类细胞是明显不同的：红系细胞特异TAL1、KLF1，巨核细胞特异F11R、PBX1和MEIS1，肥大细胞特异HES1。随后作者使用CellPhoneDB预测了成红细胞和VCAM1+ EI 巨噬细胞间的互作情况，其中VCAM1、ITGB1、ITGA4、SIGLEC1、ICAM4和SPN显著互作，而这些基因在造血过程中发挥重要作用。随后，作者通过免疫荧光鉴定出了VCAM1存在于EI 巨噬细胞中，ITGA4存在于早中期红系细胞中；此外，通过FACS发现了VCAM1+ EI 巨噬细胞与成红细胞存在互作，这可能说明VCAM1+ EI 巨噬细胞的转录谱是红系细胞与巨噬细胞的结合（见下图dotplot）。小鼠中也有类似表型。

基因筛选

48 markers在肝组织各类细胞的表达情况 与造血组织相比，卵黄囊内也存在肥大细胞，成红细胞开始表达血红蛋白基因，且在卵黄囊中，成红细胞表达HBZ和HBE1基因，到了肝脏中则转换为表达HBA1和HBG2。

卵黄囊各类细胞clusters

成红细胞血红蛋白基因表达变换 巨核细胞、红系细胞、肥大细胞及他们的祖细胞均在NLTs被检出，而HSC/MPPs则未被发现。随后作者比较了胎肝、皮肤和肾脏相应细胞类型中的高表达和差异表达基因，肥大细胞、巨核细胞、红系细胞基因表达相关性高，这种结果可能是NLT中祖细胞原位分化成熟或是不同阶段细胞在某组织中集结所致。 红系细胞在肾脏中未被检出，这表明在某些特定部位MEMps（三类细胞祖细胞）的分化是严格受限的；在CD34+血管内外均发现有GYPA+有核细胞存在，这表明MEMPs是原位成熟分化的，激光层照荧光结果支持了这一结论。MKI67和细胞周期基因的表达表征了MEMP在NLT中的增殖能力较弱；而皮肤MEMPs表达了包括MYL4在内的一些早期成红细胞基因，表明MEMPs可能在皮肤中起着红系祖细胞的作用。这表示在早期发育过程中，正常皮肤可以促进红细胞生成，作为胎肝红系细胞的补充。

肝及NLT各类细胞大致成分

各组织各类细胞差异基因

四类组织中各细胞相关度(PAGA算法)

肾脏中有MEMP但没有红系细胞

血管周GYPA检测

GYPA层照荧光结果

MKI67及调控周期基因在不同组织中的表达比较

胎肝及NLT中的淋巴细胞系分析

此前有相关报道，人胎肝中存在T细胞、B细胞、NK细胞和先天淋巴细胞。本研究发现胎肝淋巴细胞存在两个分支：一组为NK–T–ILC系，一组为B细胞系。早期淋巴样及T淋巴细胞群因妊娠期而异，在胸腺T细胞成熟之前，该群细胞表达GATA3、KLRB1、CD3D、CD7和JCHAIN，具体见下图：

免疫细胞clusters

淋巴样及T细胞marker表达水平 在妊娠早期，该群（早期淋巴样及T淋巴细胞群）可能含有早期胸腺祖细胞（ETPs），当与胸腺上皮细胞共培养时，该群可生成αβ−T细胞。在12-14 PCW阶段，细胞表达TRDC和TRAC，但不表达GZMB或PRF1，而后者是成熟CD8 + T细胞的胞质颗粒marker；而在15-17 PCW期未见TRDC表达。该发现与γδ-T细胞和αβ-T细胞在12 PCW后从胸腺中迁出而依次植入胎儿肝脏的情况相一致，且与之前研究T细胞鉴定仅可在18 PCW后进行的结果相一致。 根据PAGA和扩散映射降维结果，NK细胞（marker：NCAM1，CD7，IL2RB、CD3E）和ILC前体细胞（marker：KIT，KLRB1，IL7R和RORC）在淋巴分支中具有共同的起源。

细胞群PAGA B细胞谱系内包含了连续分化的细胞：从表达CD34, SPINK2 和 IGLL1的原始‘pre pro-B’细胞到MS4A1, CD79B, DNTT,HLA-DRA等基因表达量升高及JCHAIN 、LTB表达量下降的趋近B细胞特性的祖B细胞（Pro-B）和前B细胞（Pre-B）。祖B细胞（Pro-B）和前B细胞（Pre-B）核质比较高，且有未成熟的染色质和核仁包含其中（下图）。在HSC/MPP向B细胞转化过程中，差异调控基因包括SPIB、SP100和CTSS。前B细胞可在7-8 PCW间检测到而成熟B细胞仅可在9 PCW后检测到。

祖B和前B细胞 此外，作者分析在妊娠期Kupffer细胞中HSC/MPP中NFKBIA（一种NF-κB的抑制剂）的表达下降，而TNFSF13B（BAFF）的表达增加，NF-κB和BAFF是已知的B细胞存活与分化因子。具体关于控制胎儿肝脏中B细胞分化的细胞内因素与组织微环境因素则尚不明确。

NFKBIA与BAFF在不同细胞中的表达趋势 与肝脏及卵黄囊相比，NLTs中存在祖B细胞、前B细胞与成熟B细胞，但不存在HSC/MPPs和前祖B细胞（pre pro-B）。NLTs中的早期淋巴/T淋巴细胞、NK细胞和先天免疫细胞的转录特征与肝脏中同等细胞相同，而趋化因子与毒性颗粒的基因组织特异表达表明NK细胞的成熟与组织适应发生于肾脏与皮肤中。NLTs中的ILC前体缺乏其成熟产物：ILC1，ILC2和ILC3的全套Markers，但是卵黄囊中也存在NK细胞和ILC前体。这表明NLTs是由胎肝和卵黄囊的NK细胞和ILC前体细胞产生的，它们原位分化，表现出组织特异性。

髓样细胞的组织特征

小鼠发育轨迹分析已经证实，组织内巨噬细胞是由卵黄囊和胎肝祖细胞产生的，而DC细胞则来自骨髓衍生的HSC/MPPs，其独立于单核细胞谱系。相较于人，早在7 PCW时，已可以观察到胎儿肝脏和NLT中的髓样祖细胞，单核细胞，巨噬细胞以及DC1和DC2细胞簇。

细胞簇

发源自HSC/MPP的髓系细胞藉由三个中间体产生：表达CD34，SPINK2，AZU1，PRTN3，ELANE，MPO和LYZ的嗜中性粒细胞祖细胞；单核细胞前体；DC细胞前体。

其中，DC1不同于嗜中性粒细胞祖细胞和与DC2密切相关的DC前体，DC分化涉及CLEC11A，BATF3和ID2的动态调节，而单核细胞分化涉及S100A8 / A9，FCGR1A / 2A和S100A12的动态调节。浆细胞样DC（pDC）前体从早期前髓样细胞和前祖B细胞中分离出来，与小鼠中淋巴样和髓样来源混合的报道一致。作者比较了胎盘、卵黄囊和胎肝中的单核细胞、巨噬细胞及推定的对应前体细胞发现，巨噬细胞表达谱具有高度组织特异性，且与同组织内其他巨噬细胞的亚型有一定关联性，难以进行细胞溯源。

髓样细胞分化路径与相关模式 皮肤和肾脏中均存在单核细胞、巨噬细胞、pDC、DC1和DC2细胞；其中NLT单核细胞和DC细胞与胎肝中的单核细胞和DC细胞高度相关，而巨噬细胞更具组织特异性：对成人巨噬细胞分析发现，肝巨噬细胞表达 VCAM1 而皮肤巨噬细胞表达 F13A1。对于DC细胞而言，其组织特异性表达模式与其在不同组织中行使不同功能相对应，即在不同组织中发挥不同功能的DC细胞，具有组织特异性。如S100A4（T细胞活化因子）在皮肤DC1细胞中特异表达，而AOAH（编码参与调节脂多糖反应的酶）在肝脏DC2细胞中特异表达。这表明胎儿DC细胞在介导耐受性方面发挥积极作用。

不同髓系细胞marker表达情况

HSC/MPP分化潜能

通过FDG可视化分析发现，该细胞群以表达CLEC9A、HLA-DRA和最高水平的“ primitive”基因（包括MLLT3）为基础，该特征与可长期传代的专能干细胞（LT）-HSC细胞群一致。通过差异基因分析和监督聚类发现，HSC / MPP细胞簇的基因表达介于LT-HSC和早期祖细胞之间，类似于激发态HSC。

HSC/MPP分化轨迹

HSC/MPP分化过程中的markers变化 作者此处假设胎肝细胞的组份是由在HSC / MPP 基础上，对其多能性进行适当调节而产生的。为了证明这一猜想，作者分离了CD34+ CD38+、CD34+ CD38- CD45RA- 、CD34+ CD38− CD45RA+ 三类细胞，分别进行smart-seq2 测序和单克隆培养。通过胎肝数据集训练的支持向量机算法确定了CD34+CD38- 细胞主要为HSC / MPP（约85％）；CD34+ CD38- CD45RA+ 的大多数细胞也被分类至HSC / MPP群中。这与已报道的HSC / MPP和MLP之间的转录相似性以及作者鉴定出HSC / MPP区室中的淋巴结果吻合。

支持向量机细胞分类

CD34+ CD38- CD45RA- 的HSC / MPPs单细胞培养能长出单能细胞和专能细胞克隆。随着胎龄增加，细胞所能产生的三类克隆（红系细胞、NK细胞、髓样细胞或巨噬细胞）数越来越少（说明干性下降）。随着胎龄的增加，红系细胞克隆越来越少，而含有NK细胞和B细胞的克隆则随之增加。

克隆数目变化

同上

同上 、 胎肝中不到9 PCW的HSC / MPP几乎不产生B细胞，与这一阶段B细胞少的情况相吻合。这些发现表明不同妊娠阶段的HSC / MPP确实存在多能性差异，佐证了妊娠早期红系细胞占优和而晚期淋巴细胞增多的现象。

综合比较发育过程中多种造血组织的HSC / MPPs和早期祖细胞发现，卵黄囊和胎儿肝祖细胞和HSC / MPPs的 MKI67 表达更高，增殖潜力更强。细胞周期染色亦证实了这一结果。此外，胎肝HSC / MPPs的比例随胎龄增加而增大，表明胎儿的生命正逐渐消逝。胎肝HSC / MPPs中热休克蛋白的基因（HSPA1A）表达较高，这可能是为了维持基因组和蛋白质组的完整性；而MHC-1（HLA-B）的含量较低，这说明，与脐带血及成人骨髓中的HSC / MPPs相比，胎肝的抗原递呈能力较低。

多类造血组织中HSC / MPPs和早期祖细胞 MKI67 表达比较

细胞比例变化

以上结果表明，HSC / MPP数量、增殖和分化潜能的内在变化发生在妊娠第一阶段及第二阶段中期。这些变化可能对胎肝造血功能适应发育中胎儿的需求非常重要。

总结

提出了关于血液、胎肝、卵黄囊，皮肤和肾脏免疫发生发展的动态图谱。发现：胎儿皮肤中有生理性红细胞生成；早在7 PCW时已建立DC细胞网络；pDC可能有髓样和淋巴样细胞起源；卵黄囊可产生肥大细胞、NK细胞、ILCs；且NK 细胞、ILCs、 DCs和巨噬细胞在发育过程中产生了对应的组织特异性；揭示了在妊娠期间，HSC / MPP存在分化潜能调节，这可能是妊娠早期调节胎儿肝脏造血输出的附属机制。