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单细胞转录组分析综述
单细胞入门-读一篇scRNA-seq综述
文章信息
今天介绍的文章于2019年9月2号发表在Nature Genetics,文章题目是:A pooled single-cell genetic screen identifies regulatory checkpoints in the continuum of the epithelial-to-mesenchymal transition
Abstract
于 breast cell 中研究EMT。描述了EMT整体的transcriptomics的动态过程;并通过CRISPR的screening找到其调控者(checkpoint genes),并用其inhibitor验证了这一发现。
Workflow
scRNA-seq:
MCF10A cells的outer edge向外migrate (spontaneous EMT
)=> inner, outer cells 分别10X 上述模型,treat cells with TGF-beta (TGF-beta driven EMT
) => inner, outer cells 分别10X 上述两个模型,加以induce Loss Of Function (LOF) 的sgRNA pool(一共16 surface receptors + 24 TFs)的cell mixture => inner, outer cells 分别10X Results
1. Pseudospatial trajectory reconstruction of spontaneous EMT reveals the transition as a continuum of epithelial–mesenchymal states
将 cells 按pseudospace排列(monocle);说明model的reliability: inner & outer cells的确有Epithelial & Mesenchymal marker genes表达的区别 (inner更Epi, outer更Mes)
2. Pseudospatial trajectory alignment elucidates transforming growth factor β (TGF-β)-driven full EMT
比较spontaneous (Sp) & TGF-beta driven (Tg) 的EMT的不同
TGF-beta的确strongly prompt EMT in outer cells 相同pseudospace位点的Sp和Tg也有很多不同 上述的不同,具体体现于c中所示的各种oncogenic signatures:highlight KRAS在Tg中更激活 总体显示Tg EMT是连续的trajectory,而并非之前FACs研究所显示的 3 state的过程 与in vivo tumor进行比较:scoring (h); projection (i)
3. A pooled loss-of-function screen identifies genes regulating EMT progression
先说明模型valid:
存在EMT受到阻滞的cells TGFBR1/2的LOF (pos control)可以阻滞EMT 进一步找EMT的check point:比较sgRNA of certain genes和control sgRNA组:沿pseudospace分布的不同
不同的genes使cells enrich在pseudospace的不同位点(即,EMT的不同stages)=> potential checkpoint genes 在Ras/MAPK通路里,多个gene的LOF使cells stuck在不同的sites 用Ras/MAPK下游(RAF/MEK/ERK pathway or PI3K/AKT pathway)的多个molecule的inhibitor,检测它们是否能block EMTHighlight MEK pathway: MEK inhibition => 不影响gain in V,但阻止了loss in E. (in both Sp & Tg) 测试了5种MEK pathway的upstream regulator(Receptor Tyrosine Kinase, RTK):用药物测试了一些RTK & Integrins的inhibitorsHighlight EGFR: 但它的作用仅限于Sp而不适用于Tg 于tumor data检验这些potential checkpoint genesearly blockers与EMT score负相关;但与上述MET等正相关 Comments
方法亮点:scRNA-seq结合KO perturbation (high-throughput pooled Loss Of Functiion screening):可以研究一个dynamical process中的checkpoint genes 规矩的思路:先由data发现可能的通路 (找到KRAS),再screen该通路的下游通路(找到MEK),再screen该通路的上游RTK inhibitor (EGFR; RTK是临床更常见的靶点) 生物学发现:KRAS的不同成分一贯始终地参与调节EMT的全过程 无TGF-beta时,inhibit RAF/MEK/ERK 可以阻止loss in E & gain in V 有TGF-beta促进EMT时,inhibit MEK sign只能阻止loss in E;因此cells呈现 E & V double positive的性状 (即,经典的partial-EMT) Comp方法 (Monocle
based,毕竟出自该组)Pseudospatial construction Extract genes that vary over trajectory Aggregate gene expression scores (类似GSVA enrichment score) Align two trajectories (Dynamic time warping) Projection of scRNA-seq cells to a known trajectory (和已知trajectory的data做KNN)