T cell infiltration in old neurogenic niches

今天分享一篇2019年7月份发表在nature上的文章：《Single-cell analysis reveals T cell infiltration in old neurogenic niches》，有兴趣的同学可以自行去pubmed上下载阅读。

前言

提出问题：

人类是神经干细胞也有干细胞的niche。随着年龄的增长，niche的功能逐渐减弱，但是这期间niche发生了什么大家一直不清楚。

研究方法：

于是几个科学家就对年轻和年老的小鼠脑细胞进行了单细胞测序，分析了14685个单细胞转录组数据。

结论：

1. 发现年老的niche中激活的神经干细胞数目少，内皮细胞和小胶质细胞（可以看做是神经系统里的巨噬细胞）发生了改变，并且有T细胞的浸润。
2. 脑中T细胞和年老小鼠外周血中的T细胞不同，说明在脑中可能存在一种特殊的抗原。
3. 年老的niche中的T细胞表达γ干扰素，而脑中对γ干扰素有很强反应的神经干细胞增殖活性大大减低。

其实我想说的是，大家在看到提出的问题后，就可以先自行构思下，如果让你解决这个问题，你会采取哪些做法？用什么证据来说明问题？

我现在还没开始看正文，所以我就先谈一下我自己的想法：既然不同年龄段的神经niche发生了改变，那就肯定需要收集不同年龄段的脑组织细胞。既然做单细胞分析，那就需要确定具体的细胞类型，根据生物学背景常识知识，一般肯定是需要根据marker收集到具体的神经干细胞，起到辅助作用的间质细胞，以及作用强大而意义不明的免疫细胞。通过单细胞测序技术，分析不同年龄下干细胞发生了什么改变，间质细胞又发生了什么改变，以及免疫细胞出现了什么变化。

当然了，我们的数据不单单是转录组的测序数据，我们也可以通过流式技术看一看某一类细胞的数目改变。例如：统计下不同年龄下干细胞的数目变化，如果说年老的小鼠神经干细胞数目明显减低，那后续的研究分析过程中肯定要重点去找为什么干细胞数目减低了？以及去找哪些因素、细胞因子、其他细胞会对干细胞起到影响作用。

我也只是随便举个例子，大家可以在阅读文献的时候多思考下，这样自己的课题才会有更多的想法吧。

下面开始进入正文，让我学习下作者是怎么找证据来证明他的结论的。

背景知识

所有正文中可能需要用到的背景知识我都会补充在这里，当然只是那些我觉得我不会的知识我才会去搜集，如果你不会，但是我没有搜集，那么就请大家自己去搜索资料吧。

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SVZ区

《成年脑神经发生机制的研究进展 》中提到：

在成年哺乳动物中， 神经发生通常在侧脑室的室管膜下区-嗅球（SVZ-OB）和海马齿状回颗粒下区（SGZ）区，因而将这些区域认为是成年哺乳动物脑的“神经源性区域” 。

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星形胶质细胞

星形胶质细胞（Astroglia），是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。星形胶质细胞具有许多突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用，并参与了血脑屏障的形成。

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少突胶质细胞

少突胶质细胞的主要功能是在中枢神经系统中包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助生物电信号的跳跃式高效传递并维持和保护神经元的正常功能。其异常不仅会导致中枢神经系统脱髓鞘病变，还会引起神经元损伤或精神类疾病，甚至可以引发脑肿瘤。

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SOX2

SOX2转录因子与DNA上的OCT4形成三聚体复合物，并控制许多参与胚胎发育的基因的表达，例如YES1，FGF4，UTF1和ZFP206。对于早期胚胎发生和胚胎干细胞多能性至关重要。可能充当神经元发育的开关。下游SRRT靶标介导神经干细胞自我更新的促进。通过抵消proneural蛋白的活性使神经细胞保持未分化状态。

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CD31

CD31，又称为血小板内皮细胞粘附分子，表达在血管内皮细胞表面，可以当做血管的标志。

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巢式PCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

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TCR的组成

TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成。每条肽链又可分为可变区（V区），恒定区（C区），跨膜区和胞质区等几部分。其抗原特异性存在于V区。

V区（Vα、Vβ）又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。

一个T细胞表面有1种TCR，当某个可以和这种TCR结合的抗原存在时，这类T细胞在共刺激信号的作用下会活化，活化的T细胞可以表现为大量扩增，形成一个克隆，同时功能也会活化。

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IFN- γ

《IFN- γ 研究进展与临床应用 》中提到：

1. 干扰素是细胞被病毒感染时产生的一类细胞因子，调控感染后固有免疫和获得性免疫反应。
2. 国际干扰素命名委员会按干扰素的抗原特异性将其分为 3型：IFN- α、IFN- β 和 IFN- γ，各型又因氨基酸序列的不同分为若干个亚型， IFN- γ 可能有 4 个亚型。IFN- α 和 IFN- β 属于Ⅰ型干扰素，为病毒或人工合成的聚核苷酸诱导白细胞产生，IFN- γ 为特异性抗原（细菌、LPS） 、PHA 和卡介苗（BCG）等刺激T 细胞产生。
3. IFN-γ的来源：相比Ⅰ 型干扰素，能够产生 IFN- γ 的细胞类型较少。

在获得性免疫中，激活的 T 细胞（尤其是 CD8 +T 细胞）是 IFN- γ 的主要来源，而 NK 细胞和 NKT 细胞是固有免疫中产生 IFN- γ 的主要细胞类型。 干扰素诱导剂是一类作用于人体后，可以激活干扰素基因，促使细胞产生干扰素的物质的统称。常见的干扰素诱导剂有：病毒、细菌及其产物、致裂原（丝裂原） 、特异性免疫诱导、细胞因子（如：IL- 12）。

1. IFN-γ的作用：

• 广谱抗病毒作用。
• 抗肿瘤作用。
• 免疫调节作用：在细胞免疫过程中，大剂量 IFN- γ 起抑制作用，而小剂量可以产生促进作用。体液免疫中，小剂量 IFN- γ 主要发挥抑制抗体产生的作用。
• 抗入侵微生物作用。

1. IFN- γ 的受体在人体内广泛存在，人类细胞几乎均存在 IFN- γ 受体。但在单核细胞中的分布更多，可证明其为 IFN- γ 的主要靶细胞。IFN- γ 结合在由 IFNGR1 和IFNGR2 两个亚单位组成的糖基化的异质二聚体受体上。IFNGR1 直接与 IFN- γ结合， IFNGR2 为辅助亚基，与 JAKs 和 STATs 相互作用，触发下游的活化信号。

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BST2

干扰素诱导的抗病毒宿主限制因子，可通过将新生病毒体直接束缚在感染细胞的膜上，从而有效地阻止多种哺乳动物包膜病毒的释放。充当直接的物理束缚，将病毒体保持在细胞膜上，并使病毒体彼此连接。束缚的病毒体可以通过胞吞作用而内在化，然后降解，或者它们可以保留在细胞表面。

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Edu细胞增殖检测

EdU可以在DNA复制的时候掺入到新合成的DNA链中，通过一个“Click”反应，把荧光基团标记到新合成的含有EdU的DNA上面，这样我们就能通过检测荧光而知道细胞的增殖情况了。

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髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 MOG

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）是一种存在于中枢神经系统髓鞘最外层含量极微的髓鞘蛋白成分，是免疫球蛋白 IgG1 的一种亚型，有效的调节补体依赖性细胞毒性反应。

把 MOG 抗体用在动物体外或体内研究中提示存在补体介导的脱髓鞘，将 MOG 抗体注射到小鼠的大脑内导致髓鞘和轴索损害，改变轴索蛋白的表达，这些改变是非补体依赖性的并在 2 周内是可逆的，无炎性细胞浸润，不引起轴索脱失、神经元或星形胶质细胞坏死。

正文

取材区域的选择

作者选择了3只年轻（3个月），3只年老小鼠（28-29个月）。

作者选择从SVZ区取材，原因有以下几点：

1. SVZ是神经的发生地，，相当于人体骨髓是HSC的起源一般。
2. SVZ中有各种细胞类型，并且随着年龄的增长该部位的功能会减弱。

取到的是整个SVZ组织，通过酶的消化后处理为单细胞，上机测10x。

figure1

从b图可以看到基本上所有的T细胞都来自于年老小鼠。同时activated neural stem cells and neural progenitors (aNSCs/NPCs) 和 neuroblasts 数量上年老小鼠都变少了，而且在转录本上的信息也有所不同。

c图中可以看出，在年老小鼠中，T细胞的数目主要表现为增加。

d图展示了每一群细胞转录组的变化情况：可以看到microglia, endothelial cells and oligodendrocytes 这些细胞中转录信息改变明显。

e图通过免疫荧光染色：看到年老小鼠SVZ区中T细胞（CD3阳性）增多，并且在空间上T细胞靠近NSCs（SOX2阳性）。同时supplement2a图中证实了这些T细胞和血管内皮细胞（CD31）并不是共定位关系，证明了这些T细胞不是血液中的T细胞，而是脑实质中的T细胞。

f图展示了年轻和年老小鼠SVZ区T细胞的数量关系。

g图展示了年轻和年老小鼠SVZ区aNSCs细胞的数量关系。

看到这里，我们也许可以推断一下：年老小鼠SVZ区T细胞数目增多，aNSCs细胞却减少；而在年轻小鼠中则正好相反，那么是不是在T细胞和aNSCs细胞之间存在着相互影响呢？

上面的h图是年老小鼠的转录组数据，可以看到主要是CD8+CD4- T cells 。

i图则从转录组水平展示了年老小鼠中各种T细胞的情况。也可以看出主要是CD8+CD4- T cells 。

上面的是年老小鼠的流式数据，可以看到主要是CD8+CD4- T cells 。

前面的图虽然说明了在年老小鼠神经组织中，有大量的CD8+T细胞存在，并且NSCs细胞减少。但是如果这种现象在人中没有体现，那么这个结论也只是interesting，而没有任何价值。所以，在图l，m中，作者拿老年人的脑组织（没有神经退行性疾病）侧脑室区域的切片做了免疫荧光和计数，发现这种现象也在老年人的脑组织中存在。这就证明了这个现象的研究价值。

figure2

既然上面找到在年老小鼠和人中都有大量的T细胞存在，那么接下来理所当然大家就想看看这群T细胞到底有什么特殊之处了。于是作者收集了同一个小鼠的脑组织中的T细胞和血液中的T细胞，利用smart-seq v4进行建库测序。

图a：发现降维后blood中的T细胞和SVZ区的T细胞完全不同。分成了2群。

图b：SVZ区的T细胞高表达INF-γ（ifng）和PD-1（Pdcd1）。

在发现了SVZ区的T细胞增多后，一个很简单但是却又很关键的问题就是这些T细胞是哪里来的？是因为年纪大了后血脑屏障减弱了，还是年老后脑组织中有特殊的抗原存在，吸引了这些T细胞呢？

如果是血脑屏障减弱了，那么就是blood中的T细胞进入了脑组织，但是图a已经证明了不是这个原因，那么是不是因为脑组织中有特殊的抗原表达呢？如果是这个原因，那么所有增殖的T细胞应该都有相同的TCR。为了验证这个问题，于是作者又做了下面的实验：

通过检测TCR-β链的基因结构，判断T细胞是否由一种T细胞大量扩增而来。

c图：根据转录组数据，总结了4个小鼠中每一个样本所有的TCR-β链中基因片段的数目。

d图：同样对2只年老小鼠进行巢式PCR来验证。和上面的c图一样。

e图：分别展示了在SVZ和blood中T细胞克隆的数目。（我没看methods）可能是统计TCR-β基因的种类，如果只有一种就是single clone。如果是2种就是clone size = 2，以此类推。

f图：在SVZ和blood中，整个TCR-β基因序列种类之间的overlap情况。可以看出SVZ和blood中的TCR-β基本上没有数目overlap，也就是说，SVZ和blood中的T细胞是2群不同的T细胞。

上面的所有试验证明了，SVZ区的T细胞来源于一个不同于blood的T细胞的大量扩增。并且这类T细胞还有较高水平的INF-γ转录本水平。

figure3

作者通过看转录组信息，发现多种细胞类型表达有INF-γ受体，同时也表现出来了随年龄增长而增强的对INF-γ反应的信号。

图a：从MSigDB 数据库找到一组反映对INF-γ反应的信号。可以看出astrocytes/qNSCs, aNSCs/NPCs , endothelial cells and microglia 这些细胞对INF-γ的反应增强了。

图b：不同年龄，不同细胞类型中反映对INF-γ反应的基因表达情况——实际上纵坐标就是反映细胞对INF-γ反应的情况。只有neuroblasts 和T cells 的P值是不显著的。也就是说，其他细胞对INF-γ的反应都是在年老小鼠中有所增强的。

图c-i：通过免疫荧光和流式分析，发现在年老小鼠的aNSCs/NPCs, microglia and endothelial cells中，STAT1蛋白（INF-γ信号传导下游分子）和年轻小鼠相比是显著增加的。于是作者就认为年老小鼠中，这些细胞对INF-γ的反应性增强。

个人认为这里的验证似乎不够有说服力，毕竟STAT1这个信号分子在很多信号的传导中都会存在作用，如果只是用着一个蛋白去验证这个想法，似乎说服力不强呀！

Extended Data Fig. 5

a图：使用PCA分析，以反映对INF-γ反应性的基因作为PC进行降维展示。其中有黑色外环的小红点表示对INF-γ反应性强的细胞。

b图：3个10x样本，用上述方法进行PCA降维展示。

c图：换用另外一种数据展示的方法，数据来自3个10x样本，黑点表示对INF-γ反应性强的细胞。

年老小鼠中，astrocytes/qNSCs 和 aNSCs/NPCs 细胞群里，有一群对INF-γ反应性强的细胞亚群。

图d：（左）根据流式的结果，展现了在PROM1+的NSCs细胞中，2个年轻小鼠2和年老小鼠中STAT1的表达水平。

（右）15个年轻小鼠和14个年老小鼠STAT1的表达情况。

根据上述结果，作者认为年老小鼠NSCs对INF-γ反应性具有异质性。

那么作者就想看，这些对INF-γ具有高反应性的细胞和其他同类型细胞之间有什么区别呢？

于是作者找到一个表面marker——BST2，这个蛋白和INF-γ反应性相关，可以在INF-γ的作用下限值病毒囊泡的释放。

上面的图证明了在年老小鼠aNSCs细胞群里有BST2高表达的一小亚群。

figure4

图a：利用流式分析技术，找到了年老小鼠aNSCs/NPCs细胞群里有BST2高表达的一小亚群。并确定了圈门时的荧光强度。后面通过这个圈门策略，收集到足够的BST2+的细胞。

图b：通过bulk测序，分别测了BST2+的细胞和BST2-的细胞，找出差异基因，然后做GO和KEGG富集分析。可以看到大部分富集在对IFN-γ的反应。和前文中的结论符合。证明了用这个marker来收集细胞的可靠性。但是也发现这群细胞的cell cycle非常不活跃。

既然看到了这群细胞的cell cycle有问题，那么当然需要去看以看原因了。于是作者又做了Edu细胞增殖检测。可以看到的确是BST2-的细胞增殖活性更强。作者在这里就认为，这群细胞出现了功能的异常。

（难道NSC本身就有很强的增殖活性吗？）

接下来作者就像知道是什么导致了这些对INF-γ反应性强的细胞亚群。考虑到前面的种种结果上，作者于是将重点放在了T细胞上。

图d：通过免疫荧光，作者观察到在有T细胞临近的情况下，NSCs中的BST2信号活性就强。

作者又将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）注射到年轻小鼠脑中，结果发现BST2+NSCs细胞数增多。但是这里需要注意的是目前大家对与MOG这个蛋白分子的功能还不是很了解，但是在许多神经系统疾病中可以检测到MOG的存在。所以作者在这里也没有下很明确的结论。只是说T细胞会损害NSCs的增殖能力，而没用说是因为MOG这个蛋白抗原引起了T细胞的大量增殖。

为了证明T细胞可以直接影响NSCs的增殖能力，作者将来自脾脏的CD8+T细胞和年轻小鼠的NSCs进行共培养。

图f：整个过程图。

图g：在IL -12、IL -12和IL -18的共同作用下，T细胞会大量分泌IFN-γ。这里分别做了NSCs+CK（细胞因子）、NSCs+T cell+CK、NSCs+CK+IFN-γ抗体以及NSCs+T cell+CK+抗体同型对照。

图h、i：确认了就是IFN-γ在引起NSCs中BST2的表达增加以及增殖活性的减弱。

通过以上数据，大致可以说是T细胞分泌的INF-γ引起了NSCs中BST2的表达增加以及增殖活性的减弱。