想分析单细胞RNA的动态变化？
呐，等你关注都等出蜘蛛网了~
当你的才华还撑不起你的野心时，请潜下心来，脚踏实地，跟着我们慢慢进步。不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，通过文献速递这个栏目很幸运聚集了一些小伙伴携手共进，一起成长。
文献速递栏目通过简短介绍，扩充知识面，每天关注，希望你也能有所收获！
文章信息
单细胞技术在过去的几年间发展迅猛，但是由于得到的单细胞样品是某一时刻的静态，2018年，单细胞大牛组Sten Linnarsson和Peter V. Kharchenko在Nature上发文报道了RNA velocity of singlecells, 提出通过分析不同类群（Cluster）中RNA合成的速度（基因表达的时间导数），来深化理解单细胞RNA的动态变化过程。
大牛文章中提出的idea看起来总是棒棒的，如何应用到自己的数据分析中才是最关键的一步（当然，这里往往是n步……）
小老板很早就和我说，嗯，我们也用这个来分析下我们的数据。在拖延症大法已经拖无可拖以后，我终于开始研究如何对10x genomics的数据进行分析。
查资料
先去Velocyto官网（http://velocyto.org/），发现可以使用velocyto的python和R版本进行分析。在后续深入的阅读发现，一般是使用velocyto的python版本得到.loom文件，再使用velocyto的R版本导入.loom文件结合pagoda2进行分析。
官网给出的对10x的数据分析比较重要的两个网站为：
- https://velocyto.org/velocyto.py/，这个网站是Python的教程，给出了非常详细的步骤和例子
- http://pklab.med.harvard.edu/velocyto/notebooks/R/SCG71.nb.html 这个网站是得到了loom文件以后，如何使用RNA velocyto.R和pagoda2 （https://github.com/hms-dbmi/pagoda2 给出了如何安装pagoda2）进行分析，得到最后的分析结果
获得 loom文件
那么如何从跑完10x的CellRanger得到loom文件呢？
其实，很简单，只需要1行命令：
velocyto run10x -mrepeat_msk.gtf mypath/sample01somepath/refdata-cellranger-mm10-1.2.0/genes/genes.gtf
但是，里面有一些坑，
- Repeat_msk.gft 需要从UCSA网站下载得到：hg38_rmsk.gtf；
- mypath/sample01 ,习惯了使用Seurat分析，我下意识的使用了filtered_gene_bc_matrices中的文件夹（只包含barcodes.tsv.gz, features.tsv.gz, matrix.mtx.gz）,但是仔细阅读以后发现，此处的文件夹是cell ranger运行以后的得到的样本文件夹； velocyto includes a shortcut to run the counting directlyon one or more cellrangeroutput folders (e.g. this is the folder containing thesubfolder: outs, outs/analys and outs/filtered_gene_bc_matrices)
- 在你的outs文件夹，有一个文件名是possorted_genome_bam.bam，这是进行分析的基础，包含了splicing 相关的信息。我一直很好奇，10x的数据的矩阵如何进行RNA velocity分析，看到这个文件后我就明白了。这里需要注意的是，有的时候，这个文件会被重命名为样本名_possorted_genome_bam.bam，这里需要使用mv进行改名possorted_genome_bam.bam
- 另一个可能会发生错误的是你的cellranger的gtf文件，一定要和你的cellranger的结果的版本相匹配；
- 还需要注意的是，这个分析是依赖于samtools 1.6版本以上，由于我是在实验室的服务器上，我需要load：
- 这样直接运行velocyto run10x -m repeat_msk.gtf mypath/sample01somepath/refdata-cellranger-mm10-1.2.0/genes/genes.gtf 就可以啦！
这个分析真的是很慢很慢，python tutorial 官网说，需要大约3个小时，我今天一个约8000个细胞的样本，大概跑了2个多小时，下面的数据供参考：
等跑完数据以后，就可以去下载loom文件进行下一步分析，loom文件被保存在cellranger的sample文件下velocyto文件夹中啦~~~
敬请期待
下一期，我们来说，怎么在R中导入loom文件，进行炫酷的RNA velocity分析了。
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