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单细胞测序揭示皮肤伤口中成纤维细胞的异质性

呐,等你关注都等出蜘蛛网了~

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  1. 文献速递(简短介绍,扩充知识面)
  2. 文献详解(图文并茂带来大家系统性学习)
  3. R与Bioconductor的技巧(书籍翻译,妙招共享)
  4. scRNAseq的GitHub的书籍翻译(原汁原味的名校教程)
  5. 全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享

现在你看到的是文献速递

希望大家能有所收获!

文章信息

本期文章题目是:Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. 于2019年2月发表于Nature communications .

文章主要对小鼠背部皮肤伤口中的细胞进行单细胞测序(10X Genomics),对其中的fibroblast进行分群,发现其中一群fibroblast表达hematopoietic markers。对其进行单细胞western blot和单细胞全长测序(Fluidigm公司的C1™)分析以及一些生物学实验验证,发现hematopoietic lineage cells 可以分化成一部分的myofibroblast。

单细胞测

测序数据介绍

  • 工具: 10X Genomics
  • 测序对象: 对12只Sm22-Cre;tdTomato小鼠皮肤进行全层伤口造模12天(PW12)后,取其伤口内组织,消化成单细胞,进行单细胞测序。对通过质控的21819个细胞进行分析。
  • 测序数据:GSE113854

细胞分群分析

  • 使用Seurat 包进行聚类分析,分出13个群,根据可能的marker,对不同类细胞进行定性。
  • 比对:mm10 reference genome (GRCm38.91) using Cell Ranger Version 2.1.0
  • 细胞过滤: 初始测得~22,322个细胞,最后保留的细胞: < 8000 UMI/cell 和< 2500 genes/cell, 线粒体基因表达不多于 8% ,质控后得~21,819个细胞进行下游分析
  • 聚类分析:使用Seruat R包进行聚类分析。表达矩阵→归一化→PCA分析,挑选高变化表达的基因,expression>0.01, dispersion >1.0 → Jackstraw method挑选top40 principle component。
  • 做聚类分析 The top 40 PCs were used for clustering with the Louvain modularity-based community detection algorithm to generate cell clusters (FindClusters function, 13 clusters with resolution = 0.45).
  • 确定marker gene:不同类别之间p<0.01,log(FC)>0.25 →t-SNE分析。 对伤口中的fibroblast细胞进行再分群也是类似的方法。

其他分析

细胞周期分析

通过参考文献,确定43个G1/S期和54 G2/M期标志基因【Ref29】。使用Seurat中的CellCycleScoring函数来计算。同时用which.cells 进行定量

Pseudotime analyses伪时间分析

通过已知的fibroblast marker gene来进一步分群,用Monocle 2 来推断伪时间轨迹,再进行参考文献中的scEpath【Ref33】方法来确定伪时间依赖的gene表达变化。

RNA velocity analyses

主要分群情况

先将全部细胞分为13个群,其中的C1,C2,C4,C6,C9是fibroblast,

再将其中的fibroblast根据分为12个群

全长单细胞RNA测序

测序数据

工具:使用Fluidigm公司的C1™单细胞全自动制备系统来捕获单细胞并进行单细胞裂解、反转录,使用 Qubit 2.0测量cDNA浓度,≥1.0g可被用于下一步文库构建。

对象:对2-3只Sm22-Cre;tdTomato小鼠皮肤进行全层伤口造模后12天,15天,21天后,取其伤口内组织,消化成单细胞,通过FACS分选进行分选。

数据:GSE113605

备注:这个C1单细胞自动制备系统可同时捕获96个的细胞,在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程。做这个实验是为了确定表达血细胞marker的fibroblast在伤口后的12,15,21天是否一直存在。用这个方法比较省钱快速。

数据分析

比对和量化

比对:Bowtie(vesion 1.0.0)比对到鼠的基因组(mm10/gencode.Mv13) :rsem-prepare-reference –bowtie –gtf

量化:Expectation-Maximization algorithm (RSEM) (version 1.2.31) : rsem-calculate-expression -p $CORES –paired-end.

Samples displaying ≥ 159,000 aligned reads 被用于下游分析

质控

基因表达>11,000,线粒体基因counts大于15%,基因表达<3个细胞的全部除去,总共56个细胞被去除,留下总共288个细胞(PW12,116个细胞;PW15,100个细胞;PW21,72个细胞),进行下游分析。 使用SCnorm归一化。

意义

前人的研究中,成年小鼠皮肤造模大伤口(>1cm2)后,能够再生毛囊,小伤口(<1cm2)则没有此能力。对于其中的机制,目前认为经典的WNT信号通路在毛囊再生过程中起主要作用。随着单细胞测序的热度见长,目前单细胞测序也被应用在此领域研究,可用来了解伤口中细胞的成分和小分子,并探究哪些组分在其中其重要作用。

往期精彩

本文分享自微信公众号 - 单细胞天地(sc-ngs),作者:杰根妹妹

原文出处及转载信息见文内详细说明,如有侵权,请联系 yunjia_community@tencent.com 删除。

原始发表时间:2019-05-28

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