人脐带间充质干细胞的异质性研究
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文章信息
今天介绍的是关于人脐带间充质干细胞单细胞转录组文章，探索人脐带间充质干细胞的异质性，文章2019年5月发表于Cell Death and Diseas。文章标题是：Single cell transcriptomic analysis of human mesenchymal stem cells reveals limited heterogeneity
摘要
间充质干细胞（MSC）是一群多能细胞，具有通过调节再生和炎症优异的促进组织修复能力。MSCs在疾病治疗中的疗效依赖于产生的同源性细胞群体的相对数量。但是，体外扩增培养的MSCs的细胞异质性和分化的轨迹（方向）尚未阐明。文章分析了来源于两个脐带（UC-MSCs）的361个MSCs单细胞转录组。对这些收获于不同时期的UC-MSCs采用炎症因子刺激或者不刺激。通过加权基因相关网络分析意外发现UC-MSCs仅仅拥有有限的异质性且与供体和细胞代际无关。同时，还发现用炎性细胞因子（IFNγ和TNFα）预处理后，这种经典的策略可以提高MSCs的治疗效果，并且处理后MSCs的基因表达出现一致性的变化。基于细胞周期依赖的主成分分析显示，鉴定出具有有限异质性的这些UC-MSC与它们进入G2 / M期密切相关。并观察到特异性基因CD168以细胞周期依赖性方式表达。CD168阳性的细胞体外分选和培养时，CD168的表达依然显示出对周期的依赖。研究结果表明，体外扩增的UC-MSCs是一群具有以细胞周期为主的有限异质性的细胞。因此，本研究为基于MSCs的疾病治疗提供了标准化的信息。
背景
间充质干细胞（MSCs）是由俄罗斯科学家Alexander Friedenstein在20世纪60年代后期从骨髓（BM）中发现的多能细胞，他观察到骨髓是生物体出生后间充质组织的干细胞库。如今，MSCs的鉴定基于它们的成纤维细胞样形态，一系列的表面标志物表达状态及其三系分化潜能。由于MSCs的自我更新特性和多重分化潜能，体外扩增MSCs在再生医疗中具有广阔的前景。(人们)已经可以从各种组织和器官中分离出来MSCs，尽管骨髓来源的MSCs最广泛地用于潜在的治疗探索，脐带来源的UC-MSCs似乎更适合于临床应用。与BM-MSCs相比，UC-MSCs更易于大量获取，省去了骨髓穿刺的麻烦。重要的是,UC-MSCs源于生命的早期阶段，并且在体内移植中，具有较低的免疫原性。尽管UC-MSCs主要用于异体移植治疗，但是它们的治疗效果已经在一些临床前和临床研究中得到了证实。
在过去十几年中，由于MSCs的棉衣调节能力，显示出MSCs在组织再生的临床应用与管控炎症性疾病中取得了令人瞩目的成就。MSCs在治疗炎症性疾病具有惊人的效果，首先发现于一名患有类固醇和环孢菌素抗性GvHD5的9岁患者；然而，这一治疗效果并不是总能复现。考虑到炎症在调动MSCs免疫抑制能力关键作用，一系列的临床治疗采用联合IFNγ and TNFα炎性细胞因子来体外预处理MSCs，从而改善了MSCs在自身免疫性疾病的治疗效果。在限制MSCs在临床应用中的疗效的突出因素中，MSCs群体的标准化被归于首位。依据文献报道，MSCs在体外扩增中存在形态和增殖速率方面存在差异。此外，来自不同克隆的MSCs展现出不同的克隆集落形成和分化能力，这些证据表明，来自不同供体，组织，克隆甚至来自同一克隆集落的不同细胞的MSCs可能存在异质性。迄今为止，关于人类MSCs的大多数研究都是基于混合群体，迫切需要对MSC的单细胞分析进行详细研究，以阐明各种特性的变化。
本研究中，我们采用了最新的微流体单细胞捕获系统和高通量测序技术研究人UC-MSCs的转录组学的异质性。我们分析了361个UC-MSCs。其中的159个暴露与炎性细胞因子中。研究发现，培养的UC-MSCs存在细胞亚群。通过对这些基因的进一步分析发现，细胞周期分布是UC-MSC中异质性来源的重要原因。结合其他一些研究的信息，我们的结果表明UC-MSCs是一群相对同源的细胞群，并且分离和扩增方案中的标准化具有较高的可能获得更好的临床疗效。
测序数据介绍
采用Fluidigm C1 Autoprep System在微流控芯片上捕获细胞；NEBNext Ultra 试剂盒构建RNA文库，Illumina Hiseq 2500进行测序。在被检测的基因中，经过低表达基因过滤(在至少1/10细胞中检测到，每个细胞平均1个读数）5498个基因中的4753个被保留，这些基因所在的数据集被用于下游分析。
数据分析情况
- 数据过滤：移除含有接头，多聚N与低质量的reads；
- 比对:参考基因组hg19，Top Hat (v2.1.0)比对
- 基因过滤：采用HTSeq v0.6.1计算map到每一个基因上的read数量；归一化测序深度；差异基因使用DESeq2， Genes that had read counts with a row sum of zero were removed.。
- 聚类分析与可视化：使用SCDE软件的R包识别MSCs的亚群。简而言之，用spike-in RNAs的峰值计算基因表达水平和变异的回归线，用显著偏离拟合的基因进行分层聚类，将单个细胞分为亚群。使用SCDE软件R包进行两个条件/组的差异表达分析（每个条件下两个生物学重复）。SCDE软件包通过使用负二项分布和低水平泊松分布的混合来模拟每个基因，实现用于拟合单细胞RNA-seq测量的个体误差模型的程序。
- 数据获得：表达矩阵获得https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117837
主要分群情况
细胞分群
通过对单细胞转录组数据分析，202个未处理细胞使用外加标1,4,7的RNA或ERCC作为内参，识别 出高度可变的基因，并通过主成分分析，在所有的四个数据集中发现了（huc2_p0， huc2_p2，huc2_p5，huc1_p5）几个亚群
MSCs免疫抑制性
MSCs最独特的特征之一，是它们的免疫抑制功能和治疗各种炎性疾病的有效性。如今关注的问题是在MSCs细胞中炎症诱导的基因表达是否存在异质性。在用IFNγ和TNFα刺激后，分析了159个UC-MSCs细胞huc1_sti_p5，huc2_sti_p2和huc2_sti_p5）(Figs 1 and 2)。通过无偏的层次聚类，在所有的数据集中识别出了一个明显的亚群(Fig. 2） 。
细胞周期阶段决定了MSC的异质性
我们接下来检查了细胞周期轨迹对UC-MSCs中异质性的影响。我们采用基于评分细胞周期相关基因的分类方法，并描述每个细胞在G1/S和G2/M期中表达细胞的特征基因。通过显示红色的CD168/HMMR阳性细胞，我们发现大多数细胞位于右上方，表明它们处于G2/M期 (Fig. 4)。为了进一步证实与细胞周期相关的其他特征基因（BRCA1，CDCA5, MELK，HMMR，RACGAP，PRC和HMGB1）的相关性，我们检查了它们的表达模式，发现它们的表达与CD168/HMMR 阳性的MSCs类似，富集在图的右上角(Fig. 4)。
临床意义
我们发现，无论供体和代级如何，UC-MSCs中基因表达的异质性是有限的。此外，经炎性细胞因子（IFNγ和TNFα）刺激的UC-MSCs在基因表达中显示相似的多样性模式，表明有无炎性细胞因子刺激UC-MSCs均具有有限异质性。我们发现了包括BRCA1，CDCA5,MELK，HMMR，RACGAP，PRC和HMGB1在内的七个特征基因。更深一步地分析显示，异质性在很大程度上与UC-MSCs的细胞周期阶段有关。自从骨髓中首次鉴定获得MSCs后，如今几乎可以从所有的组织中获得MSCs。骨髓来源的BM-MSCs在临床应用中最为常见，与来自它组织中的MSCs相比，UC-MSCs具有大规模扩增和标准化的巨大潜力。UC-MSCs单细胞基因谱分析显示个体细胞存在异质性，不同细胞分别表现出明显的增殖和分化潜能。基于UC-MSCs大小的分类显示，形态较小的细胞生长更快，更为年轻。此外，利用多色慢病毒条形码标记作为UC-MSC克隆发育的分析工具，发现在体外扩增期间可以减少MSCs的异质性。因此，体外扩增的MSCs间的异质性的鉴别和应用反应了它们在疾病治疗中应用的治疗机会。考虑到不同供体来源和扩增过程中可供选择的MSCs的克隆。
为了揭示UC-MSCs有限异质性的本质，我们分析了特征基因，发现绿松石模块与细胞周期调控有非常密切的关系。令人意想不到的是观察到了细胞周期基因聚类的模块和免疫相关分子聚类的模块之间负相关性。我们发现UC-MSCs亚群大多处于G2/M期，UC-MSCs的异质性（有无炎性细胞因子刺激）均受细胞周期进程的控制。总之，我们通过对UC-MSC单细胞RNA测序的分析揭示了UC-MSC的异质性主要是由细胞周期阶段的不同分布引起的。除了在研究MSC生物学方面有价值之外，该信息还对MSC标准化和采用MSC治疗各种疾病的发展具有重要意义。