eLIFE：脑电结合眼动研究：自闭症儿童社交脑网络的早期改变

社交障碍是自闭症谱系障碍(ASD，Autism Spectrum Disorders)的标志，但是在ASD研究中缺乏针对社交性刺激引起早期社交脑网络改变的证据。我们记录了ASD学步儿童及其正常发育（TD, typically developing）的同伴在探索动态社交场景时的注视方式和大脑活动。基于电信号溯源的定向功能连接分析，揭示了theta和alpha频率的特定频率非典型脑网络。结果发现，与自闭症相关的社交网络的关键节点信息在传输和连接方式均发生了变化。对ASD脑与行为关系的分析表明，来自背顶额叶，颞下叶和岛状皮层区域的补偿机制与较少的非典型注视模式和较低的临床障碍有关。本结果提供了有力的证据表明：社交脑网络的定向功能连接改变是ASD大脑早期非典型发育的核心组成部分。

研究要点

新生儿容易被声音，面部表情和社交行为所吸引。在日常生活中注意这些社交线索有助于婴幼儿学习如何与他人互动。在这段发展过程中，大脑不同部位之间形成了可帮助儿童理解他人社交行为的大脑连接网络。

后来发展为自闭症谱系障碍(ASD)的婴儿出生后的第一年较少关注社交线索，对这些重要线索的漠不关心会导致ASD儿童出现社交缺陷。他们无法理解他人的行为或进行典型的社交互动。但是，自闭症儿童对社交线索敏感度较低的原因却尚未可知。理解社交行为的大脑网络的发展可能也会因此而受到影响。因此，研究这种网络如何在正常发育的儿童和患有自闭症的儿童中的发展是有非常意义的。

Sperdin等人的研究证实，患有自闭症谱系障碍的儿童与正常儿童在社交大脑网络方面存在差异。在实验中，Sperdin等人记录患有ASD和未患有ASD的3岁左右儿童观看其他儿童玩耍的视频时，他们的视线和大脑中发生的事情。用眼动仪追踪眼动，并使用脑电仪器记录EEG活动。

患有自闭症的儿童所看的东西与正常发育的同龄人不同，这些差异与处理社交信息的大脑网络的变化相关。症状较轻的ASD儿童的这些大脑网络活动较强，他们所看的也与正常发育的孩子更相似。这表明，受影响较轻的自闭症儿童也许能够以增强网络活动的方式使其症状得到改善。

在生命早期识别类似的ASD行为和大脑差异有助于科学家更好地了解导致该病的原因。它还可以帮助临床医生在生命最早期大脑最适宜塑造的情况下提供更多的个性化干预方案。为了更好地了解干预如何影响这些变化，有必要对ASD儿童的这些脑网络差异进行长期研究。

材料和方法

被试

研究共招募120名ASD儿童和正常发育的儿童。排除伪迹过多以及不愿佩戴EEG设备的参与者，最终剩余36名参与者：18名ASD儿童(2名女性;平均年龄3.1岁±0.8)和18名年龄相匹配(p = 0.852)的TD儿童(5名女性;平均年龄3.1岁±0.9)。

ASD参与者在实验之前均接受了临床诊断。ASD程度通过《孤独症诊断观察时间表》或《孤独症诊断观察时间表》第二版(ADOS-2)进行了严格的测试和确认。参与者特征详见表1。

表1 参与者特征表

实验材料

刺激是两组由动态社交图片组成的视频，每个视频大约两分钟且无声音信息。视频中图片是具有高生态效度的复杂动态图像，比如幼儿独自练习瑜伽，模仿动物的行为(像猴子一样跳跃或像青蛙一样跳跃)，松开双臂，摆姿势，跳跃，做鬼脸或吹口哨，视频呈现方式和呈现时间由Tobii Studio软件控制。

实验程序和任务

为了使孩子熟悉实验程序，在初次参与实验前两周家长会收到了一套含有定制EEG电极帽和显示实验流程的材料。实验前，参与者坐在父母的膝盖上，以尽可能使他们感到安全，并最大程度地减少参与者的头部和身体的移动。随后，研究人员测量参与者的头围并为其佩戴相应型号的EEG电极帽。

实验开始前花费几分钟让参与者适应实验环境和电极帽。之后，使用Tobii系统进行五点眼动跟踪校准，程序如下：在白色背景上呈现一个有吸引力的彩色物体(小猫，公共汽车，鸭子，狗或玩具)及其相应的声音，参与者视线必须跟随该物体。当每只眼睛至少获得四个校准点时，便开始记录和呈现视觉刺激。

为了更好地吸引孩子的注意力，我们首先向他们展示了一个适合其年龄的动画，然后是一些几何图形和社交图片视频。该实验模块以本实验感兴趣的社交图片视频结尾。以相同的顺序向所有参与者呈现相同的视觉刺激。在第一个实验模块结束后，重新检查电极的电阻，并在需要的地方重新调整，以便将电阻保持在40 kOhm以下。然后进行第二个实验模块(卡通动画;几何图形;卡通动画;第二个感兴趣的条件：社交图片视频)。实验者连续记录参与者视线运动情况，以确保孩子正在看屏幕。整个实验持续大约半个小时。

眼动测量

使用TX300 Tobii眼动仪记录眼动数据(采样率为300 Hz)。为了分析和量化两组之间视觉探索的差异，我们开发了一种数据驱动的方法来定义动态视觉场景探索的标准。

1) 在包含复杂社交图片视频的每个时间帧上使用kernel密度分布估计，计算基于TD组眼动数据的标准注视点分布。

2) 对于每个ASD参与者，我们分别计算出一个相对标准注视点分布的偏差指数，并且每个单位时间范围分别计算出该指数(图6)。

3) 我们在两部影片中将这些值取平均，以获得平均连接指数值(PI, Proximity Index )。该指数代表ASD参与者与TD组标准注视点分布的距离。较高的指数值表示更接近TD视觉探索的视觉行为(相似性更高)，而较低的指数值表示偏离TD组的视觉行为(相似性更低)。

图6 在某个随机帧上的每组注视点分布。

每个点代表一个参与者的注视位置。真实的实验中，参与者可以看见图片中儿童的具体面孔信息，此处模糊处理以保护图片中儿童的信息。

脑电采集和预处理

脑电数据使用采样率1000Hz的129导Hydrocel Geodesic Sensor Net记录。使用顶点作为参考电极，以0-100Hz进行在线带通滤波。使用Matlab和Cartool进行数据预处理。

1）去除脸颊和脖子的无用电极，最后保留111个电极。

2）使用non-causal filtering滤波器进行1-40Hz带通滤波和50Hz凹陷滤波。

3）每个数据由三位EEG专家中的一位进行检查，以去除存在运动伪影和参与者没有看屏幕的时间段。

4）通过独立成分分析(ICA)识别和除去与眼睛相关的成分。

5）使用球形插值法（spherical spline interpolation）对具有较大噪声的通道进行替换。

6）将数据降采样至125Hz，并采用平均参考对数据进行重参考。

7）由两名EEG专家对数据进行检查，以确保预处理后的数据中没有任何伪迹。

电溯源成像和兴趣区域的选择

具体的分析策略详见图7。通过电溯源成像(Electrical source image, ESI) 重建头皮EEG活动的来源。为此，我们使用了幼儿大脑模型(33-44个月)(MNI)，并考虑了颅骨的厚度(Locally Spherical Model with Anatomical Constraints，LSMAC)。灰质中均匀分布了4159个体素。

1）使用分布式线性逆推(distributed linear inverse solution)(低分辨率电磁层析成像，LORETA)来计算3D电流源密度。

2）将该3D偶极子时间序列对应到每个感兴趣区域(ROI)跨时间和数据片段的主要偶极子方向上，从而获得标量时间序列。

3）在使用SPM8对MNI空间进行标准化后，根据AAL图谱将灰质分成了82个ROI。为了减少空间维数，我们将最接近每个ROI中心的采样点视为该ROI活动的代表，以进行进一步分析。这样就可以获取代表82个ROI的82个点的跨时间源激活。

图7 溯源的分析策略

使用格兰杰因果关系(Granger-causality)进行定向功能连接

定向功能连接通过估计一个信号施加到另一个信号上的影响来研究大脑区域之间的方向关系。格兰杰因果关系认为：给定一个过程中的两个信号，如果对一个信号的过去信息的了解可以更好地预测过程中另一个信号的存在，则前一个信号被认为格兰杰-导致后一个信号。

Granger因果模型是一种经过充分验证的统计方法，该方法已成功地应用在头皮EEG研究大鼠和颅内记录研究非人类灵长类动物大脑区域之间定向相互作用的强度。它也成功的通过EEG和MEG的源成像研究健康人的脑连接模式，同时也已经有效地应用于临床人群中，通过颅内记录以及电记录源成像研究局灶性癫痫患者的网络变化。

为了获得可解释的结果，应使用电溯源成像而不是在头皮测量上进行格兰杰因果分析。因此，为了估计数据中的方向关系，我们使用82个源信号计算加权部分定向相干性(weighted Partial Directed Coherence，wPDC)。PDC是一种可以在同一模型中同时考虑所有信号，并在频域中估计大脑连接的多变量方法。它通过确定模型强度的多元自回归模型计算。

1）为每个参与者和每个数据片段计算wPDC，然后取平均值。随后，通过平均PDC减去最小值并除以范围在ROI和频率(1-40Hz)上按比例缩放到0-1。

2）对每个电极进行快速傅里叶变换(FFT)，将ESI分别应用于FFT的实部和虚部，然后合并它们来获得每个参与者的平均SP并进行缩放(即0-1，与PDC相同)。

对于每个参与者，我们获得了3D连接矩阵(ROI x ROI x频率)，表示每个频率从一个ROI到另一个ROI的信息传输。

为了进一步分析，我们通过计算每个频率的平均连接值，将连接矩阵缩减为3个频率：theta(4-7Hz)，alpha(8-12Hz)和beta(13-30Hz)。对于每个被试和频率，我们将总输出（summed outflow ）设定为从给定ROI到所有其他ROI的wPDC值之和。这反映出此ROI在网络中的总输出重要性：具有较高总输出的ROI强烈促进了其他ROI的活动。我们发现，theta频段中的总输出最高，其次是alpha频段。因此，我们将随后的分析集中在这两个频段上。

使用非参数统计检验对不同组参与者的总输出进行统计比较(Mann-Whitney-Wilcoxon，双尾p <0.05)。然后，计算从一个ROI传递到剩余81个ROI的总输出，并对组与组之间的这些总输出进行统计分析，结果显示两组之间的总输出具有统计学意义。将82个ROI中每个ROI的总输出结果与ADOS-CSS评分、PEP-3中的发育评分、VABS-II中的适应性评分和眼跟踪数据的PI值进行了相关分析(Spearman-rho，双尾p<0.05)。所有相关p值经Benjamini-Hochberg p=0.05多重检验校正。使用Matlab进行连接值计算。

结果

总输出

为了解动态社交信息加工背后的大脑功能连接和其动态变化，我们使用了一种数据驱动的方法来探索在整个大脑82个ROI中最高的输出发生在哪个频段。具有较大总输出的ROI在将活动指向网络中其他ROI方面起着关键作用。

两组中最强的总输出均发生在theta频率(4-7 Hz)。图1a中说明了两组不同区域的总输出在频率上的分布。可以看出，两组的最大活动峰出现在theta频率(4–7 Hz)中，然后是alpha频率(8–12 Hz)中。在theta和alpha频段中两组总输出能力没有差异，且两组在theta频率中的总输出均高于在alpha频率中的总输出(p＜0.0001)。两组共有的几个区域在两个频率上都有较大的总输出，特别是双侧额内侧和眶额上区、双侧海马、双侧ACC和右侧杏仁核(图1b)。

图1 多个频率的最大信息传输区域的总输出。

在theta频段上，与TD组相比，ASD组在以下6个ROI上具有更高的信息传输力(总输出更强)：额上回右眶部，额中回两侧眶部，右侧扣带回中部，左枕上回和左颞上回(图2a)。这表明，在观看动态社交图片视频时，与TD同龄人相比，ASD儿童这些区域的激活更高。在alpha频段，与TD组相比，ASD组在以下三个ROI上具有不同激活：额中回右眶部和左楔骨具有较高的激活，而右侧STG具有较弱的激活(图2a)。图2b和图2c的箱形图分别代表了theta和alpha频段上每个组和每个重要ROI的总输出。

图2 ASD组与TD组的总输出。

区域-区域定向功能连接

使用Granger因果模型，分别在theta六个节点中的每个节点以及alpha三个节点中的每个节点上计算了区域间功能连接的组间差异。在theta频率，来自ASD儿童的六个ROI的所有连接都强于TD参与者中最强的关联。这表明ASD儿童中存在theta频段区域间强连接。图3中显示了theta频段上六个ROI的区域间定向功能连接。对ASD儿童的六个ROI区域间定向连接的估计(即某个ROI指向其他ROI的活动)也揭示了ASD与TD不同的网络模式。

在alpha频段中，区域-区域定向功能连接分析显示，与TD同龄人相比，ASD儿童从额中回右侧眶部和左侧楔骨出发的连接更强，而从右侧STG出发的连接较弱。与theta频段中发现类似的结果，ASD儿童alpha频段的它三个重要ROI的网络连接模式都与TD同伴不同(图4)。

图3 两组theta频段(4–7 Hz)出现的区域间定向功能连接的六个重要ROI(红色大球)。

总输出用箭头表示：箭头越大，输出越强。通过ICBM平均大脑轴向和冠状视图呈现ROI及其网络连接。首字母缩写词请参阅表2。

补充图1 ASD组theta频段的ORBsup.R种子(红色大球)。

补充图2 TD组theta频段中的ORBsup.R种子(红色大球)。

图4 两组alpha频段(8–12 Hz)出现显著的区域间定向功能连接的三个ROI(红色大球)。

总输出用箭头表示：箭头越大，输出越强。通过ICBM平均大脑轴向和冠状视图呈现ROI及其网络连接。首字母缩写词请参阅表2。

与ADOS-2，PEP-3，VABS-II和注视连接指数（PI）的关系

我们进一步探讨了theta和alpha频段各ROI总输出与ASD临床行为量表之间的关系。两个频段各自总输出和ADOS-2严重度评分之间的相关系数均未通过FDR校正。对于theta频段的总输出，右侧舌回的总输出与社交性标准得分(p = 0.0001)，以及VABS-II的休闲和游戏技能的标准分数之间存在强正相关(p = 0.0003)。alpha频段的总输出与VABS-II标准评分的相关系数均未通过FDR校正。在靠近岛叶后回的左侧Heschl和靠近脑岛环状沟的左侧罗兰盖内，较高总输出与PEP-3测量的精细动作(p = 0.0004)和大肌肉运动技能(p = 0.0004)呈正相关。在左海马和左侧罗兰盖内较高的alpha总输出与PEP-3测量的精细动作(p = 0.0005)和大肌肉运动技能(p = 0.0005)呈正相关。

与TD同龄人有相似注视模式的ASD儿童的theta频段总输出在左中扣带回皮层(p = 0.0007)和右中央小叶(p = 0.0005)增加。FDR校正后，PI与alpha频段的总输出之间没有显著相关。图5显示了每个频率的总输出与PI，VABS-II标准评分和PEP-3标准评分之间的显著相关性。

最后，我们探索了注视时间与PEP-3发育评分，VABS-II适应性评分(D'Agostino-Pearson综合测试，K2，p <0.05; Pearson's r，双尾p <0.05)之间的关联。通过校准ADOS-2严重度评分，我们没有发现PI与自闭症严重程度的整体水平之间存在显著相关性。然而，我们发现，视线追踪表现较好的ASD儿童具有更好的整体适应功能(pK2 = 0.1883; pr = 0.012)，更好的整体运动能力(pK2 = 0.6643; pr = 0.013)和良好的运动技能(pK2 = 0.7619; pr = 0.031)，以及人际关系的发展更好(pK2＝ 0.0704; pr＝ 0.011)。我们还发现，根据PEP-3的测量，这些视线追踪更好的儿童具有更好的视觉运动模仿能力(pK2 = 0.263; pr = 0.022)。

图5 FDR校正后，ASD参与者theta频段的总输出(蓝点)与(a)标准化VABS-II评分，(b)PEP-3标准分和(c)PI之间存在显著相关。(d) FDR校正后alpha频段的总输出和PEP-3标准分显著相关。TD组的总输出以红色绘制在Y轴上。通过ICBM平均大脑轴状面俯视图呈现相应ROI。

表2 缩略词信息表

解读观点：

本研究使用头皮EEG和眼动追踪仪记录ASD儿童和TD同伴在单纯观看含有丰富社交性信息的视频时大脑活动与视线活动(无认知任务)，并利用EEG溯源技术讨论了ASD儿童在theta和alpha频段的社交脑网络上的改变。研究发现，自闭症幼儿时期已经出现社交网络的改变，改变主要表现在基础认知功能有关的theta节律和与注意相关的alpha节律上，并且在某种程度上与其自闭症严重程度有关。