在线功能富集分析与qPCR引物设计
之前写的RNA-seq数据差异表达分析一文中提到，筛选得到差异表达基因list后，需要进一步分析这些基因参与了哪些功能，因此要进行后续的一些分析，比如功能富集分析、聚类分析和基因共表达网络分析。这次主要介绍在线功能富集分析与qPCR引物设计。其中在线功能富集分析可利用本人所在课题组开发的agriGO和PlantGSEA在线分析工具，分别进行GO富集分析和基因集富集分析。
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在线功能富集分析
1agriGO网站进行GO富集分析
Gene ontology，基因本体，简称GO。分为细胞组分（cellular component, CC），分子功能（molecular function, MF）和生物过程（biological process，BP）三部分。GO旨在描述基因和蛋白质的功能，且能对基因功能进行分类，并且适用于所有物种。目前是对组学数据分析以及组学平台的一个有利支持。agriGO网站是一个面向植物的在线GO富集分析工具，目前支持对农业297个物种869种基因型/蛋白质标识符基因列表的GO富集分析。
打开agriGO网站(http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/)，通过"Species"选择一个物种点击打开：
点击"[ath]"使用提供的gene list例子或者输入自己筛选到的差异表达基因list，然后选择一个背景"Select reference"，并点击"Submit"，得到富集分析结果：
其中：
"Analysis Brief Summary"是对富集分析结果的总结
"Graphical Results"可对BP、CC和MF类GO条目分别进行有向无环图可视化
"GO flash Chart"可对BP、CC和MF类GO条目分别进行柱形图可视化展示
"Detail information"是指具体的富集分析结果
在"Detail information"中可点击"Download"下载具体富集分析结果，该数据可用clusterProfiler包可视化富集分析结果，具体参考教你用clusterProfiler实现其它来源富集结果的可视化一文。其中BP类GO条目有向无环图可视化如下所示：
上图中，颜色越深，代表富集的GO条目越显著。此外，针对多个gene list（可以是在不同样本中上下调的基因），可以通过"add"添加多个gene list同时分析：
然后点击"Submit"进行分析：
红框中点击"SEACOMPARE"：
点击"Submit"提交两个job ID进行分析，一次性得到两个不同gene list的富集分析结果：
2PlantGSEA网站进行基因集富集分析
基因集富集分析 (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) 的原理，可参考GSEA——从原理到实战一文。PlantGSEA是面向植物的基因集富集分析工具，它支持对16种植物利用gene list进行基因集富集分析，先验知识的基因集包括GO注释数据集，基因家族数据集，人工注释基因集（PlantCyc、KEGG和参考文献等），miRNA targets和TF targets等。
打开PlantGSEA网站(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PlantGSEA/)，点击"analysis"进入到分析界面：
首先确定物种，然后根据右下角标注已有物种对应的已有先验知识基因集，选择合适的基因集：
点击"Start Analysis"进行分析：
2
qPCR引物设计
目前有很多软件和在线工具可以进行引物设计。了解引物设计的原理和一些注意事项是设计好的引物的前提条件。常见的有ChIP-qPCR和qPCR引物设计。针对qPCR引物设计，对引物的要求有：
设计引物尽量靠近3'端（保证扩增效率）尽量跨越内含子（检测基因组污染）引物长度最好在18-22bp产物长度保证在80-200bp间，最长可300bp两条引物Tm值不能相差太大，一般在55-65摄氏度GC量一般在40%-60%之间这里介绍用Primer-BLAST，DNAMAN和Beacon Designer来进行引物设计。
1Primer-BLAST
Primer-BLAST整合了Primer3软件和BLAST的功能，可以设计引物，也可以对引物进行特异性验证（也可以用NCBI blast实现）。首先，进入NCBI Primer-BLAST界面。该界面主要分为模板，引物区和特异性验证三个部分。然后在模板部分输入fasta序列或基因号（NCBI）；接着，如果有设计好的引物，可以在引物部分（"Primer Parameters"）的"Use my own forward/reverse primer"后面输入设计好的引物（可以检测设计引物的特异性）；在"PCR product size"后面，输入引物长度要求（80-200），最小和最大退火温度（Tm值）分别填55和65。
在特异性验证部分，如下图所示选择，填上对应的物种名或通用名。
然后勾选"show results in a new window"，并点击"Get Primers"。
2DNAMAN
DNAMAN是一个常用的核酸序列分析软件，它可以用来多序列比对，质粒图谱绘制，限制性酶切分析和引物设计等等。功能丰富，用起来也很方便。这里主要介绍引物设计，有关注其他功能的可以自行挖掘。
首先，准备好序列fasta格式文件，通过"文件|打开命令"读取该文件。
点击"引物|设计DNA的PCR引物(D)"，按引物要求修改出现的对话框，如下所示：
其中，3'二聚体是指形成3'端互补的碱基数，发夹颈环是指形成发夹颈环的碱基数，所有匹配是指引物互补配对的百分比。
然后点击"下一步"按钮，对话框如下所示：
选择酶，再点击"下一步"按钮得到最终结果：
可以点击设计的一对引物查看具体信息。特异性验证可以利用NCBI blast进行。
3Beacon Designer
Beacon Designer是一款专业的定量PCR引物设计软件，它也可以用于设计TaqMan探针等。在引物设计方面，主要包含引物设计和引物比对检测引物特异性两个部分。
打开Beacon Designer 8.14软件，创建新的project，如下所示：
准备好fasta格式序列文件，通过"File|Open|Sequence|From file"输入序列文件，如下所示：
搜索引物的保守序列：
点击"search"，得到：
其中右上角黄色部分为相对保守序列，设计引物时应尽量避开。
通过"Analyze|Primer Search"开始设计引物，按照引物设计要求选择：
然后点击"Search"，得到：
红框中显示引物设计进度，表明最终的引物选择最优的，最下方是设计引物的详细信息。
在右下方点击"All Primers"查看所有的引物信息：
右下角可点击"Replace"查看其它引物的详细信息。
qPCR引物特异性验证
通过以上三种方法设计的引物，可利用NCBI blast辅助进行qPCR引物特异性验证。首先，打开NCBI blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网页，点击"Basic BLAST"中的"nucleotide blast"选项：
在"Enter Query Sequence"下方输入引物序列（正反都可以），在"Database"一栏中选择NCBI NR库，输入对应物种拉丁学名或通用名，点击"BLAST"进行比对：
常用的数据库资源：
1) 组学相关
NCBI (National Center for Biotechnology Information)
GEO (Gene Expression Omnibus)
SRA (The Sequence Read Archive)
ArrayExpress
2) 蛋白质相互作用相关：
BioGRID
IntAct
MINT
3）通路相关：
BioCyc
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)
4）基因组注释相关：
Ensembl
Ensembl Plants
Phytozome
Gramene
5) 功能富集分析相关
DAVID
agriGO
PlantGSEA
