单细胞转录组技术梳理（三）

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单细胞转录组技术梳理（一）

单细胞转录组技术梳理（二）

SMART-seq

SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一个具有里程碑意义的重要技术。在2012年由美国和瑞典科学家共同开发，发表在《Nature Biotechnology》。作为一种单细胞测序方案，它能够在覆盖完整的转录本，能够在全基因组范围内挖掘调控网络，从而实现对单细胞转录组本异构体分析和SNA检测。尤其适用于对等位基因特异性表达或剪接变体的深入研究。

具体流程

从少量或单个细胞进行cDNA扩增和文库制备：

• 首先在逆转录兼容缓冲液中裂解细胞，
• 以polyA RNA为模板，然后用带接头的oligo(dT)为引物，在SMART逆转录酶（SMARTScribeTM Reverse Transcriptase）作用下，引发反应，合成一链。
• 当合成到达模板的5'末端时，由于SMART逆转录酶具有末端转移酶活性，所以会在cDNA的3'末端增加几个碱基
• 模板转换和掺入SMART er II A Oligonucleotide。（此时一段5'端带接头3'端与cDNA 3'末端延伸碱基反向互补的引物（SMARTer II A Oligonucleotide）与cDNA 3'末端延伸碱基进行互补配对）
• 逆转录酶以该引物为模板继续延伸，得到两端带接头的完整单链cDNA序列，利用PCR扩增全长cDNA以获得几纳克的DNA。
• 片段化，以生成测序文库。

优缺点

优势：

• 每个细胞单独建库
• 样本浓度要求低，起始材料低至50pg，灵活性高
• 可达单碱基分辨率，定位水平高
• 转录本覆盖度高

劣势：

• 非链特异性建库
• 转录本长度具有偏向性，对超过4Kb的序列不能高效转录
• 高丰度转录本被优先扩增
• 纯化步骤可能导致材料损失