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NGS测序中PCR重复序列的判定方法

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生信修炼手册
发布2020-05-07 16:11:32
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发布2020-05-07 16:11:32
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文章被收录于专栏:生信修炼手册生信修炼手册

在NGS的数据分析中,去除PCR重复序列是一个常见的分析步骤,无论是WES/WGS的snp calling,还是chip_seq, ATAC_seq,都需要对原始的bam文件进行过滤,去除其中的PCR重复序列。

为了完成这一工作,常用的工具有以下几种

1. samtools

操作SAM/BAM文件,samtools肯定是首选的工具。在samtools中也提供了去除PCR重复的命令markdup, 该命令对输入的bam文件有以下两点要求

  1. 必须是经过samtools fixmate命令处理之后的文件
  2. 必须是按照比对上染色体坐标位置排序之后的文件

另外,由于fixmate命令要求输入的bam文件为按照read name,即序列名称排序之后的文件,所以在使用markdup命令时,需要以下4步转换过程

代码语言:javascript
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# 第一步,按照read name排序bam文件
samtools sort -n -o namesort.bam input.bam
# 第二步,运行fixmate命令
samtools fixmate -m namesort.bam fixmate.bam
# 第三步,按照coordinate排序bam文件
samtools sort -o positionsort.bam fixmate.bam
#第四步,运行markdup命令
samtools markdup positionsort.bam markdup.bam

虽然samtools处理bam文件的速度很快,但是经过这一系列的排序操作之后,整个duplicate做的过程耗时非常久。

2. picard MarkDuplicates

picard的MarkDuplicates命令称得上是使用的最广泛的去除PCR重复的工具了,要求输入的bam文件为按照比对位置排序之后的文件,用法如下

代码语言:javascript
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# 第一步,按照coordinate排序bam文件
samtools sort -o positionsort.bam input.bam
# 第二步,运行MarkDuplicate命令
java -jar picard.jar MarkDuplicate \
I=positionsort.bam \
O=markdup.bam \
M=markdup.metrc.csv
3. sambamba

sambamba是一款比samtools速度更快的操作BAM文件的工具,也提供了markdup命令,其PCR重复的判定方法和picard是一致的,用法如下

代码语言:javascript
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# 第一步,按照coordinate排序bam文件
sambamba sort -o positionsort.bam input.bam
# 第二步,运行markdup命令
sambamba markdup positionsort.bam markdup.bam

除了这三种方法之外,还有很多的工具可以去除PCR重复序列,只不过这3种方法最为常见,其中sambamba的操作速度最快,推荐使用。

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原始发表:2020-01-04,如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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